加味茵陳四逆湯預(yù)防給藥對(duì)肝纖維化幼鼠TGF-β1-Smads通路的影響.pdf

1、肝纖維化是一個(gè)可逆的創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)，也是所有慢性肝臟損傷的必經(jīng)通路。隨著疾病負(fù)擔(dān)日益下降，年輕患者中出現(xiàn)門靜脈高壓的后遺癥、肝衰竭和肝硬化相關(guān)肝細(xì)胞癌的越來越多。全球疾病負(fù)擔(dān)預(yù)測(cè)肝硬化和肝細(xì)胞癌占到全球所有死亡人數(shù)的2.5％，肝移植是唯一有效治療失代償性肝病的方法;然而，北美和歐洲已出現(xiàn)供體器官短缺的情況，這一現(xiàn)象導(dǎo)致等待肝臟移植患者的死亡率增加約20％。不僅僅成人會(huì)出現(xiàn)肝纖維化，嬰幼兒也很常見。膽道閉鎖在活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病約1/5000～1

2、/19000，而亞洲國家發(fā)病率比歐洲國家更高。膽道閉鎖肝纖維化是一種普遍和突出的疾病特點(diǎn)，其肝纖維化進(jìn)展速度明顯超過其他肝膽疾病，90天以上的患兒已不宜行肝門腸吻合術(shù)（Kasai術(shù)），需要行肝移植才能長期生存;嬰兒肝炎綜合征是一組嬰兒期（包括新生兒期）起病的臨床癥候群，以黃疸、肝臟病理體征（肝腫大、質(zhì)地異常）和肝功能損傷為特征。由于致病因素的持續(xù)作用和機(jī)體免疫功能失調(diào)，肝細(xì)胞直接受損或免疫損傷，纖維組織不斷增生，肝臟組織漸漸由炎癥受損階

3、段過渡到肝纖維化階段，以膠原蛋白、蛋白多糖及粘連蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)過度沉積為其主要病理變化。目前肝纖維化研究較多且較為關(guān)鍵的信號(hào)通路即為TGF-β1/Smads信號(hào)通路，藥物阻斷或干預(yù)TGF-β1/Smads信號(hào)通路能有效影響或遏制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展?，F(xiàn)藥物大多數(shù)針對(duì)成人肝纖維治療，小兒用藥少之又少，以及早且有效干預(yù)、毒副作用小為目標(biāo)，人們將研究目光轉(zhuǎn)投中醫(yī)藥，希冀從中醫(yī)藥當(dāng)

4、中探尋到防治肝纖維化的有效藥物。
　　本課題組在前期臨床研究已表明加味茵陳四逆湯對(duì)小兒膽道閉鎖Kasai術(shù)后治療可改善臨床癥狀、延緩術(shù)后肝纖維化的發(fā)生、提高患兒的生存質(zhì)量;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了加味茵陳四逆湯對(duì)肝星狀細(xì)胞的TGF-β1/Smads信號(hào)通路方面有一定作用，但加味茵陳四逆湯的藥物療效和作用機(jī)理尚留有空白。同時(shí)，本研究也是國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“加味茵陳四逆湯對(duì)膽道閉鎖小鼠肝纖維化模型TGF-β1/Smads通道及MMPs/TIM

5、Ps的影響研究（課題編號(hào):81373686）”的部分內(nèi)容。
　　目的:
　　觀察加味茵陳四逆湯對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化幼鼠模型的預(yù)防干預(yù)作用，研究其對(duì)臟器指數(shù)、肝臟病理組織學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)的影響，并從TGF-β1/Smads信號(hào)通路方面探索其可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　將42只Wistar雄性幼鼠隨機(jī)分為空白組、溶劑對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組、加味茵陳四逆湯高劑量組、加味茵陳四逆湯中劑量組、加味茵陳四逆湯低劑量

6、組，每組6只。除空白組、溶劑對(duì)照組外，其余各組幼鼠均腹腔注射0.15ml/kg50％CCl4，溶劑對(duì)照組幼鼠腹腔注射0.15ml/kg橄欖油，均為每周2次，連續(xù)21天。溶劑對(duì)照組和模型組每日給予滅菌水10ml/kg灌胃，秋水仙堿組每日給予秋水仙堿0.1mg/kg灌胃;加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組每日分別予加味茵陳四逆湯16.46g/kg、8.23g/kg、4.12g/kg灌胃;空白組不做任何處理，每日1次給藥，給藥周期21天。于實(shí)驗(yàn)第

7、22天進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血和提取肝臟、脾臟樣本。將提取肝臟和脾臟于電子天平稱重，測(cè)定肝、脾指數(shù);通過HE染色觀察肝臟情況，采用Ishak評(píng)分系統(tǒng)了解肝纖維化程度;以賴式微板法檢測(cè)血清ALT、AST水平;通過競(jìng)爭性抑制酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定血清HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ含量;采用RT-qPCR檢測(cè)TβRI mRNA、Smad3mRNA、Smad7 mRNA、CollagenⅠ mRNA、CollagenⅢ mRNA的表達(dá);采用Wester

8、n Blot檢測(cè)TβRI、Smad3、Smad7、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.加味茵陳四逆湯對(duì)肝指數(shù)和脾指數(shù)的影響
　　與空白組相比，模型組肝指數(shù)、脾指數(shù)明顯升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組肝指數(shù)、脾指數(shù)無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，秋水仙堿組、加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組肝指數(shù)、脾指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。
　　2.加味茵陳四逆湯對(duì)肝組織的影響

9、>　　(1)空白組和溶劑對(duì)照組幼鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，匯管區(qū)及其周圍未見小膽管及纖維組織增生。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，甚至消失，肝索排列紊亂，匯管區(qū)大量增生的纖維，呈條索狀，從匯管區(qū)伸向相鄰的匯管區(qū)形成纖維橋連并分割肝實(shí)質(zhì)，肝間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤。秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組存在肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞可見腫脹和明顯脂肪變性，肝間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤，而且匯管區(qū)都有不同程度的肝纖維化表現(xiàn)，但纖維化程度均較模型組有明顯的減輕

10、。
　　(2)空白組和溶劑對(duì)照組沒有纖維化發(fā)生（P＞0.05）;模型組與空白組比較病理評(píng)分顯著升高（P＜0.05）;秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組與模型組比較病理評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。
　　3.加味茵陳四逆湯對(duì)血清ALT、AST的影響
　　與空白組相比，模型組ALT、AST顯著性升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組ALT、AST無明顯差異(P＞0.05);與模型組相比，秋水仙堿組、加味茵陳四逆湯高、中、

11、低劑量組ALT明顯降低(P＜0.05)，而各用藥組AST無顯著性差異（P＞0.05）。
　　4.加味茵陳四逆湯對(duì)血清HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ的影響
　　與空白組相比，模型組HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ顯著升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組各指標(biāo)無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，除加味茵陳四逆湯低劑量組HA、LN無顯著性差異（P＞0.05）外，各用藥組HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ明顯降低（P＜

12、0.05）。
　　5.加味加味茵陳四逆湯對(duì)Tβ RI mRNA、Smad3 mRNA、Smad7mRNA、CollagenⅠ mRNA、CollagenⅢ mRNA表達(dá)的影響
　　(1)與空白組相比，模型組Tβ RI mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、中劑量組Tβ RI mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），加味茵陳四逆湯低劑量

13、組無明顯差異(P＞0.05)。
　　(2)與空白組相比，模型組Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，溶劑對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05);與模型組相比，秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯中劑量組Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），加味茵陳四逆湯高、低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。
　　(3)與空白組相比，模型組和溶劑對(duì)照組Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05）;與模型組相

14、比，加味茵陳四逆湯中劑量組Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)，秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、低劑量組無明顯差異（P＞0.05）。
　　(4)與空白組相比，模型組CollagenⅠ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，溶劑對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，加味茵陳四逆湯中劑量組CollagenⅠ mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、低劑量組無明顯差異(P

15、＞0.05)。
　　(5)與空白組相比，模型組CollagenⅢ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，秋水仙堿組、加味茵陳四逆湯高、中劑量組CollagenⅢ mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，加味茵陳四逆湯低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。
　　6.加味茵陳四逆湯對(duì)TβRI、Smad3、Smad7、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)的影響<

16、br>　　(1)與空白組相比，模型組TβRI蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，各用藥組TβRI蛋白相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異(P＞0.05)。
　　(2)與空白組相比，模型組Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，溶劑對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，加味茵陳四逆湯中、低劑量組Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。
　　(3)與空白組相比，

17、模型組Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）:與模型組相比，各用藥組Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異(P＞0.05)。
　　(4)與空白組相比，模型組CollagenⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，各用藥組CollagenⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05）。
　　(5)與空白組相比，模型組Collage

18、nⅢ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），溶劑對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05);與模型組相比，加味茵陳四逆湯中劑量組CollagenⅢ蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　加味茵陳四逆湯高、中、低三個(gè)劑量對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化幼鼠預(yù)防給藥能不同程度上減輕幼鼠肝臟炎癥和纖維化程度以及脾臟癥狀。加味茵陳四逆湯可降低ALT、HA、LN、IV-C、PCOL-Ⅲ，同時(shí)HA、LN的變化與藥物濃度存在相關(guān)性。提示加