LUMINEX-MPMA和NGS技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病具有進(jìn)展迅速，致死致殘率高等特征。導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體種類(lèi)達(dá)100多種，包括病毒，細(xì)菌，真菌，寄生蟲(chóng)等。但目前的病原體檢測(cè)方法（如鏡檢、培養(yǎng)、ELISA檢測(cè)、生化、PCR檢測(cè)等）陽(yáng)性率低、診斷周期長(zhǎng)，且無(wú)法達(dá)到高通量檢測(cè)病原體的要求。由于缺乏高通量、陽(yáng)性率高的診斷方法，60％-85%的患者無(wú)明確病原學(xué)診斷[1]，患者被給予經(jīng)驗(yàn)型治療，不僅導(dǎo)致了抗生素的濫用及微生物的耐藥，并且給患者帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此

2、，為有效降低該類(lèi)疾病的不良影響，在臨床上對(duì)導(dǎo)致疾病的病原體進(jìn)行高特異性、高通量、快速的檢測(cè)的方法是迫切需要的。
　　本研究利用LuminexTM-200和NGS技術(shù)，以疑診病毒性腦（膜）炎患者腦脊液為標(biāo)本，建立能同時(shí)篩查18種病原體的LuminexTM-200平臺(tái)及探索性研究二代測(cè)序分析技術(shù)能否應(yīng)用于腦脊液標(biāo)本檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)未知病原體。
　　第一部分基于LuminexTM-200平臺(tái)高通量檢測(cè)18種病原體方法的建立
　　目

3、的：通過(guò)LuminexTM-200平臺(tái)建立一種通量高、特異性強(qiáng)的可同時(shí)檢測(cè)18種中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病原體的核酸檢測(cè)平臺(tái)。
　　方法：建立基于LuminexTM-200為平臺(tái)的MPMA-PCR體系，該體系應(yīng)用Luminex磁珠微陣列標(biāo)記，多重 PCR及溫度轉(zhuǎn)移擴(kuò)增等三種策略，可同時(shí)擴(kuò)增18種病原體（HSV-1，HSV-2，VZV，CMV，EB，MeV，MuV，JCV，JEV，ECHO，EV71， CA16，HEV，C.neoforma

4、n，M.tuberculosis，S.pneumonia，T.gondii，A.cantonensis）。首先，針對(duì)18種病原體的特異性基因序列構(gòu)建質(zhì)粒并作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的基礎(chǔ)之上建立 MPMA-PCR體系并以 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證MPMA-PCR體系的特異性。通過(guò)檢測(cè)倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)MPMA-PCR體系95%最低檢出濃度。其次，收集177例腦脊液樣本（包括138例疑診病毒性腦（膜）炎腦脊液樣本，19例經(jīng)商業(yè)化

5、試劑盒檢測(cè)的腦脊液樣本，20例非腦（膜）炎腦脊液樣本），使用MPMA-PCR體系進(jìn)行檢測(cè)，并以測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)該體系檢測(cè)臨床樣本的可行性、特異性及靈敏度。
　　結(jié)果：
　　（1）MPMA-PCR體系的建立：通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的檢測(cè)，確認(rèn)MPMA-PCR體系可針對(duì)18種病原體特異性基因同時(shí)檢測(cè)。MPMA-PCR體系檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，特異性為100％。應(yīng)用probit模型分析MPMA-PCR各引物的95%最低檢出限HSV-

6、2、VZV、EB和MuV的引物的95%最低檢出限為103copy/reaction。其余14對(duì)引物95%最低檢出限均高于100copy/reaction。
　?。?）臨床樣本的檢測(cè)：應(yīng)用MPMA-PCR體系檢測(cè)177例腦脊液樣本病原核酸陽(yáng)性率23.16%（41/177）：HSV-1病毒檢出率為7.9%（14/177）；HSV-2病毒檢出率6.21%（11/177）；EB病毒和?？刹《緳z出率為2.25%（4/177）；巨細(xì)胞病毒和帶

7、狀皰疹病毒各2例；腮腺炎病毒、CA16、EV71和EV68各1例。陰性對(duì)照樣本，未檢測(cè)到病原體。MPMA-PCR體系檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果達(dá)到95.48%的一致性。
　　結(jié)論：建立一種基于LuminexTM-200平臺(tái)高通量、高特異性的MPMA-PCR體系，該體系可同時(shí)檢測(cè)18種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體。MPMA-PCR體系檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序驗(yàn)證達(dá)到100%的符合率。通過(guò)對(duì)臨床疑診病毒性腦（膜）炎患者腦脊液標(biāo)本檢測(cè)，MPMA-

8、PCR體系病原體檢出率可達(dá)23.16%，特異性達(dá)到100%。針對(duì)檢出率較低，我們主要考慮兩方面原因，第一，導(dǎo)致出現(xiàn)類(lèi)似病毒性腦膜炎癥狀的原因可能超出MPMA-PCR體系目標(biāo)檢測(cè)范圍。第二，疑似腦（膜）炎的病例，可能由于致病病原體數(shù)量少，才導(dǎo)致癥狀不典型，且核酸含量低于MPMA-PCR檢測(cè)的最低檢測(cè)濃度。綜合以上原因，MPMA-PCR體系，靈敏度并不太理想。但是結(jié)合金標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)結(jié)果顯示，該體系具有較高的特異性。
　　第二部分 NGS技

9、術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染未知病原體檢測(cè)的探索性研究
　　目的：實(shí)驗(yàn)第一部分結(jié)果顯示，MPMA-PCR體系具有較高的特異性，但是靈敏度缺乏。仍有部分腦脊液樣本病原體信息不能明確，為進(jìn)一步明確這些樣本的病原體信息，我們探索性應(yīng)用靈敏度更高的二代測(cè)序平臺(tái)（NGS），以期發(fā)現(xiàn)其它可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體。
　　方法：收集經(jīng)第一部分實(shí)驗(yàn)仍無(wú)明確病原體信息的腦脊液樣本21例（為未知病源組）和12例明確診斷為隱球菌腦膜炎患者腦脊液樣本

10、（為隱球菌組）作為陽(yáng)性對(duì)照，利用NGS技術(shù)對(duì)33例未知病原體樣本檢測(cè)進(jìn)行探索性研究；NGS陽(yáng)性結(jié)果利用qPCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：12例隱球菌腦膜炎樣本經(jīng)NGS檢測(cè)，83.33%（10/12）樣本中存在隱球菌序列。經(jīng)qPCR平行驗(yàn)證陽(yáng)性率為33.33%（4/12）；21例未知病原體樣本中，28.57%（5/21）高度可能病原菌包括：克雷伯桿菌1例，肺炎鏈球菌1例，無(wú)乳鏈球菌1例，結(jié)核桿菌1例，假單胞菌1例；14.28%（3/

11、21）的樣本經(jīng)qPCR確認(rèn)樣本（包括1例克雷伯桿菌，1例肺炎鏈球菌，1例無(wú)乳鏈球菌）。NGS在本次腦脊液樣本建庫(kù)成功率僅為72%（24/33）。
　　結(jié)論：針對(duì)隱球菌陽(yáng)性對(duì)照樣本檢測(cè)，83.33%的樣本中存在隱球菌序列，但qPCR驗(yàn)證檢測(cè)僅33.33%的樣本檢出隱球菌。這一結(jié)果表明根據(jù)隱球菌組二代測(cè)序技術(shù)的靈敏度高于qPCR。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照樣本的NGS檢測(cè)結(jié)果表明，NGS技術(shù)針對(duì)腦脊液中病原體核酸檢測(cè)具有可行性，且高靈敏度。經(jīng)NGS