腦損傷后腦脂結(jié)合蛋白表達及作用機制研究.pdf

1、第一部分 TBI后皮質(zhì)損傷區(qū)BLBP表達變化及其對星形膠質(zhì)細胞增殖的影響
　　目的：
　　探討成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）后大腦皮質(zhì)損傷區(qū)域腦脂結(jié)合蛋白（brain lipid binding protein，BLBP）的表達變化及其對體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細胞C6增殖、遷移能力及侵襲性的影響。
　　方法：
　　1．SD大鼠隨機分為對照（Control）組和TBI組；<

2、br>　　2．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d應用免疫熒光法檢測大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)BLBP、GFAP表達情況并計數(shù)BLBP+/GFAP+細胞；
　　3．提取TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠損傷區(qū)周圍腦皮質(zhì)總蛋白，Western blot檢測BLBP蛋白表達；
　　4．體外培養(yǎng)C6細胞，分為LV-BLBP和LV-NC兩組，取最佳MOI時C6細胞總蛋白和總RNA，Western blot和r

3、eal-time PCR檢測C6細胞病毒感染后BLBP蛋白和mRNA表達；
　　5．EdU標記S期C6細胞，免疫熒光技術(shù)和流式細胞術(shù)檢測C6細胞增殖水平；
　　6．CCK-8檢測培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h和120h C6細胞活力；
　　7．兩組細胞在10％FBS培養(yǎng)條件和1%FB的培養(yǎng)條件培養(yǎng)3d，提取總蛋白Western blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白p16、p21、p27的表達；
　　8．劃痕實驗

4、和Transwell實驗檢測C6細胞遷移能力及侵襲性。
　　結(jié)果：
　　1．傷后1d、3d、7d、14d、21d和28d損傷區(qū)皮質(zhì)均能觀察到BLBP+/GFAP+的細胞，傷后7d細胞數(shù)量達到高峰而后逐漸下降，28 d時僅能在損傷區(qū)皮質(zhì)邊緣觀察到少量BLBP+/GFAP+細胞。對照組大鼠皮質(zhì)偶見陽性細胞。
　　2．TBI后損傷腦區(qū)BLBP蛋白表達：TBI后損傷區(qū)周圍皮質(zhì)BLBP表達量明顯上升，7d時達到高峰，隨后緩慢下降

5、，至28d依然高于正常組。
　　3．Western blot結(jié)果顯示感染BLBP過表達重組慢病毒后C6細胞顯著表達BLBP蛋白，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見感染BLBP之后C6細胞能夠轉(zhuǎn)錄BLBP mRNA。
　　4．免疫熒光和流式細胞術(shù)檢測EdU標記增殖態(tài)C6細胞，結(jié)果顯示10%FBS培養(yǎng)條件感染BLBP后細胞EdU陽性細胞更多，與空病毒組相比差異有統(tǒng)計學意義。改變培養(yǎng)條件至1%FBS培養(yǎng)基依然可見BLBP感染組EdU陽性細胞比

6、例明顯較空病毒組高。
　　5．CCK-8檢測C6細胞活力：10%FBS培養(yǎng)條件下與空病毒組比較BLBP感染后C6細胞在24h、48h、72h和96h細胞活力高于空病毒組。1%FBS培養(yǎng)條件BLBP感染組C6細胞在72h、96h和120h細胞活力高于空病毒組。
　　6．Western blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白p16、p21、p27表達：蛋白條帶顯示在10%FBS培養(yǎng)條件下BLBP感染組和空病毒組p16無明顯差異，而在1%F

7、BS培養(yǎng)條件下BLBP感染組p16蛋白表達明顯下降，與空病毒組比較差異有統(tǒng)計學意義；p21蛋白的表達結(jié)果顯示不管在10%FBS培養(yǎng)條件還是在1%FBS培養(yǎng)條件下BLBP均能有效降低其表達，組間比較差異明顯；p27蛋白檢測結(jié)果顯示在兩種培養(yǎng)條件下BLBP的表達與否均未能明顯影響其表達。
　　7．劃痕實驗和Transwell實驗檢測C6細胞遷移情況未見BLBP過表達和空病毒感染組C6細胞遷移能力有明顯差異。
　　第二部分體外培養(yǎng)

8、C6細胞過表達BLBP基因芯片檢測與分析
　　目的：
　　為探討C6細胞過表達BLBP對相關(guān)下游基因表達影響，并分析、篩選感興趣的靶基因。
　　方法：
　　1．體外培養(yǎng)C6細胞，分為LV-BLBP和LV-NC兩組；
　　2．基因芯片檢測、分析；
　　3．提取培養(yǎng)C6細胞總蛋白，Western blot檢測C6細胞病毒感染后TGF-β2蛋白表達。
　　1．基因芯片檢測結(jié)果：以差異表達基因探針信號差

9、異篩選出的264基因探針進入分析，過表達BLBP后相對于空病毒感染C6細胞有284個基因上調(diào)和250個基因下調(diào)。與神經(jīng)細胞有關(guān)的基因中轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor2，TGF-β2）編碼基因在BLBP過表達后明顯上調(diào)。
　　2．Western blot檢測C6細胞TGF-β2蛋白表達：蛋白電泳結(jié)果顯示過表達BLBP后C6細胞TGF-β2蛋白表達明顯上調(diào)，與空病毒組細胞比較差異有統(tǒng)計學意義。

10、>　　第三部分 TGF-β2對星形膠質(zhì)細胞生物學行為的影響
　　目的：
　　探討成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）后大腦皮質(zhì)損傷區(qū)域轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β2，TGF-β2）的表達變化及其對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞株HA1800增殖和遷移能力的影響。
　　方法：
　　1．SD大鼠TBI模型制備，分為對照組和TBI組；
　　2

11、．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d應用免疫熒光法檢測大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)TGF-β2、GFAP表達情況并計數(shù)；
　　3．取TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠損傷區(qū)周圍腦皮質(zhì)，提取總蛋白Western blot檢測TGF-β2蛋白表達；
　　4．體外培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細胞株HA1800細胞，分別給予0ng/mL、2ng/mL和10ng/mL外源性TGF-β2因子。3d后EdU標記S期HA1800細

12、胞，檢測細胞增殖狀態(tài)；
　　5．培養(yǎng)基中添加TGF-β2終濃度為0ng/mL、2ng/mL和10ng/mL，流式細胞術(shù)檢測HA1800細胞周期，計數(shù)各期細胞占總細胞百分比，了解細胞周期狀態(tài)；
　　6.劃痕實驗檢測不同濃度外源性TGF-β2對HA1800細胞遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1．免疫熒光檢測結(jié)果顯示傷后1d、3d、7d、14d、21d和28d損傷區(qū)皮質(zhì)均能觀察到TGF-β2+/GFAP+的細胞。傷后

13、7d達到高峰而后逐漸下降，28 d時依然能在損傷區(qū)皮質(zhì)邊緣觀察到較多的TGF-β2+/GFAP+細胞。對照組大鼠皮質(zhì)未見TGF-β2+陽性細胞。
　　2．Western blot結(jié)果顯示TBI后TGF-β2表達量明顯上升，7d時達到高峰，隨后緩慢下降，至28d表達依然高于正常組。
　　3．隨外源性TGF-β2濃度的增加EdU陽性標記的細胞數(shù)目明顯增多。
　　4．流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示外源性TGF-β2進入培養(yǎng)基后，HA

14、1800細胞周期發(fā)生明顯變化。隨著TGF-β2在培養(yǎng)基中終濃度的上升，處于G2/M期的HA1800細胞數(shù)量逐漸增加，變化趨勢與S期細胞類似，10ng/mL組最多；反之G1期細胞數(shù)量則呈下降趨勢。
　　5．劃痕實驗結(jié)果顯示，不同濃度外源性TGF-β2干預后細胞均能向中央空白處遷移，尤以3h和6h時明顯，至20h時空白處兩側(cè)的細胞已完全遷移進入并相互接觸，組間比較以10ng/mL組細胞遷移效果最佳。
　　第四部分 TBI后皮質(zhì)損

15、傷區(qū)TGF-β1的表達及其對神經(jīng)干細胞分化的作用
　　目的：
　　探討成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）后大腦皮質(zhì)損傷區(qū)域轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達變化及其對體外培養(yǎng)大鼠NSCs分化的影響。
　　方法：
　　1．制備SD大鼠TBI模型；
　　2．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d應用免

16、疫熒光法檢測大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)TGF-β1、IBA-1、GFAP表達情況；
　　3．Western blot和Elisa檢測TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠損傷區(qū)周圍腦皮質(zhì)TGF-β1表達變化；
　　4．培養(yǎng)SD大鼠來源NSCs，分NSCs組、TGF-β1組、NSCs+Smad2 RNAi組和TGF-β1+Smad2 RNAi組，免疫熒光染色檢測NSCs分化為Map-2陽性和GFAP陽性細胞情況。

17、>　　結(jié)果：
　　1．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d損傷區(qū)皮質(zhì)均能觀察到GFAP+/TGF-β1+和IBA1+/TGF-β1+的細胞。損傷區(qū)皮質(zhì)GFAP+/TGF-β1+細胞數(shù)量逐漸上升，傷后7d達到高峰而后逐漸下降，28 d時僅能在損傷區(qū)皮質(zhì)邊緣觀察到少量TGF-β1+/GFAP+細胞。IBA1+細胞在損傷后一天即有表達，隨時間點的延長IBA1+/TGF-β1+雙標陽性細胞數(shù)量快速上升，3d后上升速度放緩至14

18、d達到高峰而后逐漸下降，28d時損傷區(qū)周圍偶見IBA1+/TGF-β1+陽性細胞。
　　2．Western blot和Elisa檢測結(jié)果顯示，TBI后TGF-β1表達量明顯上升，3d時達到高峰，隨后緩慢下降，14d后形成平臺期。
　　3．體外培養(yǎng)NSCs給予不同濃度外源性TGF-β1因子干預，結(jié)果顯示不同時間點均能見到GFAP+細胞數(shù)量變化，3d時間點2ng/mL TGF-β1干預后NSCs分化為GFAP+細胞較0ng/mL

19、組明顯增多，隨著TGF-β1濃度的提高GFAP+細胞數(shù)未見增多，反而有所減少，但與0ng/mL組比較差異依然明顯。7d時間點GFAP+細胞表現(xiàn)的趨勢與3d時間點類似。
　　4．MAP-2、GFAP免疫熒光檢測Smad2 RNAi后NSCs分化情況：培養(yǎng)14d結(jié)果顯示加入2ng/mL的TGF-β1后MAP2陽性細胞分化比例較正常NSCs分化比例下降明顯。TGF-β1+Smad2 RNAi組MAP-2陽性細胞的比例較TGF-β1組有所

20、增加，但未能達到正常培養(yǎng)組或NSCs+Smad2 RNAi組水平。
　　結(jié)論：
　　1．大鼠TBI后，損傷區(qū)皮質(zhì)BLBP、TGF-β1/2表達上調(diào)，并能與GFAP共標；
　　2．過表達BLBP能夠通過下調(diào)細胞周期抑制蛋白p21、p16的方式來重置細胞周期并促進C6細胞增殖，但對C6細胞的遷移能力和侵襲性無影響；
　　3．C6細胞過表達BLBP后能夠上調(diào)TGF-β2的表達水平；
　　4．TGF-β2表達上調(diào)能