Netrin-1基因表達(dá)對(duì)顱腦損傷后大鼠血腦屏障影響作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后病灶神經(jīng)組織出現(xiàn)不同程度的變性壞死,腦組織自身供血調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)變化,血腦屏障功能出現(xiàn)異常,自身通透性改變,并發(fā)生血管性與細(xì)胞毒性腦組織水腫,神經(jīng)組織細(xì)胞生化代謝紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)變化。而中樞神經(jīng)組織,血腦屏障及脈管系統(tǒng)修復(fù)都與神經(jīng)導(dǎo)向因子(neural guidance factor)有著密切的聯(lián)系,越來(lái)越多的研究跡象表明,顱腦損傷后血腦屏障的變化過(guò)程中有多種神經(jīng)導(dǎo)向因子參與?；谝陨涎芯?/p>

2、背景,本課題擬通過(guò)檢測(cè)大鼠顱腦損傷模型中 Netrin-1基因及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的變化,觀察Netrin-1基因?qū)δX微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的影響,以求進(jìn)一步了解Netrin-1基因?qū)︼B腦損傷后微血管的調(diào)節(jié)機(jī)制,希望為顱腦損傷的治療提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法:
　　采用改進(jìn)型Feeney自由落體重型顱腦損傷大鼠模型模擬顱腦損傷。將90只成年SD(Sprague–Dawley)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假

3、手術(shù)組、顱腦損傷(TBI組)和陰性對(duì)照組。Evans Blue法檢測(cè)顱腦損傷后腦組織中血腦屏障完整性的改變情況;采用免疫熒光法、RT-PCR、Western-Blot法檢測(cè)Netrin-1及TJ相關(guān)蛋白閉合蛋白-5(claudin-5)、咬合蛋白(occludin)和胞質(zhì)緊密粘連蛋白-1(ZO-1)在三組大鼠腦組織中的表達(dá)情況(傷后6h、24h、48h、72h、96h),并分析Netrin-1與claudin-5、occludin及ZO

4、-1之間的相關(guān)性;又將大鼠顱腦損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外分離及培養(yǎng);構(gòu)建含 Netrin-1全長(zhǎng)基因的真核表達(dá)載體pZsGreen1-C1-Netrin-1;觀察Netrin-1基因過(guò)量表達(dá)對(duì)大鼠顱腦損傷后血腦屏障影響。具體如下:分三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn):空白對(duì)照組(PBS代替質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組),陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體組)和實(shí)驗(yàn)組(Netrin-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)。2、觀察轉(zhuǎn)染Netrin-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后三組大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中TJ相關(guān)蛋白閉合蛋白-5

5、(claudin-5)、咬合蛋白(occludin)和胞質(zhì)緊密粘連蛋白-1(ZO-1)的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　1、建立了基于改進(jìn)型Feeney自由落體腦損傷裝置的大鼠顱腦損傷的動(dòng)物模型。隨著顱腦損傷發(fā)生時(shí)間的延長(zhǎng),腦組織中神經(jīng)元變性的程度也逐漸加重,間質(zhì)也可出現(xiàn)水腫、出血的改變。Evans Blue法檢測(cè)顱腦損傷后血腦屏障完整性的結(jié)果表明,手術(shù)組中腦實(shí)質(zhì)中 EB染料的含量隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,于72小時(shí)時(shí)相

6、時(shí)達(dá)到高峰,96小時(shí)時(shí)逐漸下降,與假手術(shù)組相比具有明顯的差異。而在顱腦損傷模型中,免疫熒光和蛋白電泳檢測(cè)均表明血管內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接(Tight Junction,TJ)相關(guān)蛋白(claudin-5、occludin及ZO-1)的表達(dá)明顯降低,而Netrin-1的表達(dá)呈逐步上升。
　　2、根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典方法,我們成功分離并體外培養(yǎng)了大鼠顱腦損傷模型中腦組織里的血管內(nèi)皮細(xì)胞。分離得到的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有典型的內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)

7、,呈貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞梭形或星形,有伸長(zhǎng)的觸角,與周圍細(xì)胞相互吻合形成連接;構(gòu)建的含有Netrin-1全長(zhǎng)基因的表達(dá)載體pEGFP-C1經(jīng)過(guò)測(cè)序和酶切驗(yàn)證,確定插入的序列準(zhǔn)確無(wú)誤。
　　3、通過(guò)免疫熒光檢測(cè),穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-Netrin-1表達(dá)載體的內(nèi)皮細(xì)胞中目的基因Netrin-1的表達(dá)顯著升高,表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào);蛋白電泳結(jié)果表明, Netrin-1的表達(dá)含量也明顯升高;免疫熒光、蛋白電泳和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn), N

8、etrin-1轉(zhuǎn)染組中內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)緊密連接相關(guān)蛋白(claudin-5、occludin及ZO-1)的表達(dá)量均隨著的Netrin-1含量的增加而顯著升高,兩者之間呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　1、基于改進(jìn)型Feeney自由落體腦損傷裝置,成功建立了大鼠顱腦損傷的動(dòng)物模型,分離并體外培養(yǎng)了損傷模型中腦組織血管內(nèi)皮細(xì)胞,為后續(xù)進(jìn)一步深入研究顱腦損傷時(shí)血腦屏障的改變情況奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2、顱腦損傷發(fā)生后,腦組織