鐵離子在實驗性腦室出血后腦損傷中的作用機制及干預(yù)研究.pdf

1、腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是常見的卒中亞型，發(fā)病率高居卒中第二位。腦出血發(fā)病急驟，病情往往十分兇險，發(fā)病后1月內(nèi)病死率可高達50％，且幸存者多有嚴重的神經(jīng)功能障礙。然而，腦出血后腦損傷的機理仍不夠清楚，亦缺乏經(jīng)嚴格驗證有效的治療措施。在腦出血患者中，合并腦室出血(intraventricular hemorrhage，IVH)的發(fā)生率高達50％以上，腦室出血以及繼發(fā)形成的腦積水將進一步加重腦損傷，

2、是臨床腦出血患者預(yù)后不良的獨立危險因素，近年來逐步受到關(guān)注。因此，腦室出血及繼發(fā)性腦積水的防治研究已成為腦出血領(lǐng)域關(guān)注的新方向，明確IVH后腦損傷機制及探索有效的干預(yù)措施對提高臨床腦出血患者的治療效果具有重大意義。
　　目前，腦室出血后腦損傷及繼發(fā)腦積水的確切病因及機理還不是很清楚，也缺乏有效的藥物治療措施1。IVH后病理損傷機制可能包括:早期梗阻性腦積水導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高、腦室內(nèi)血腫的占位效應(yīng)、血液代謝產(chǎn)物的毒性作用和繼發(fā)慢性腦積水

3、等2。然而，IVH后血液代謝產(chǎn)物與腦損傷和慢性腦積水之間的關(guān)系尚缺乏研究。近年來，血腫及其代謝產(chǎn)物的毒性效應(yīng)作為腦出血后腦損傷的重要研究方向取得了較大進展。ICH后數(shù)日內(nèi)血塊開始融解，鐵離子作為血紅蛋白的主要降解產(chǎn)物過量集聚導(dǎo)致組織鐵超載和氧化損傷，造成血腦屏障受損、腦水腫及神經(jīng)元死亡等。相應(yīng)的，鐵螯合劑去鐵敏干預(yù)措施在多種ICH動物模型研究中均被證實具有神經(jīng)保護效應(yīng)，因此研究ICH后鐵超載相關(guān)損傷及治療措施意義重大。
　　腦室出

4、血后鐵代謝紊亂及其在繼發(fā)腦損傷中的作用尚不清楚，我們分析IVH后溶血產(chǎn)物可廣泛播撒至全腦室系統(tǒng)及蛛網(wǎng)膜下腔，與腦室壁及腦組織接觸面更為廣泛，鐵超載及相關(guān)損傷可能在IVH后腦損傷及腦積水發(fā)生中同樣具有重要作用。因此，我們推測:IVH后腦室內(nèi)積血逐步代謝后有大量鐵離子釋放，可能導(dǎo)致顯著的腦鐵超載，并引起腦室壁室管膜纖毛上皮、腦室旁組織等氧化應(yīng)激損傷，從而參與IVH后腦損傷及慢性腦積水的發(fā)生發(fā)展。本課題以IVH后鐵超載及氧化損傷為主要切入點，

5、觀察大鼠實驗性IVH后腦損傷、腦積水和鐵代謝特征，并分別采用去鐵敏、米諾環(huán)素和依達拉奉進行干預(yù)，觀察在鐵超載和氧化損傷兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)的干預(yù)效應(yīng)，分三部分研究驗證上述推測:第一部分采用不同血液制品行大鼠單側(cè)腦室注射建立IVH損傷模型，明確IVH后腦損傷、腦積水和鐵代謝相關(guān)特征，觀察鐵螯合劑去鐵敏干預(yù)是否能減輕IVH后腦損傷;第二部分采用腦室內(nèi)鐵離子注射模型，觀察鐵離子在腦室內(nèi)的直接腑損傷效應(yīng)，以及米諾環(huán)素對腦室內(nèi)鐵損傷的保護效應(yīng)，進一步證明

6、鐵離子可能參與了IVH后繼發(fā)損傷及腦積水形成;第三部分采用實驗性大鼠IVH模型，觀察自由基清除劑依達拉奉對IVH后氧化應(yīng)激損傷及腦積水的干預(yù)效應(yīng)，驗證氧化損傷參與IVH后室管膜損傷及腦積水發(fā)生的推測。
　　一、鐵離子在大鼠實驗性腦室出血后腦損傷中作用及去鐵敏的干預(yù)研究
　　目的：
　　通過側(cè)腦室注射自體全血、抗凝血或紅細胞建立大鼠腦室出血模型，動態(tài)觀察出血后腦損傷、腦積水、腦鐵沉積和鐵代謝相關(guān)蛋白表達變化，以及鐵螯合劑

7、去鐵敏的干預(yù)效應(yīng)，從而評估鐵離子超載在腦室出血后腦損傷中的作用及鐵螯合治療的意義。
　　方法：
　　實驗分為3部分，第一部分將實驗動物分成生理鹽水對照組(Saline)、自體血組(Bloodor IVH)及抗凝血組(Heparinied blood)，分別將200μl生理鹽水、自體血及自體抗凝血注入大鼠右側(cè)腦室，分別于1天、3天、7天、14天和28天行MRI掃描，并于上述時象點留取腦標本行組織學(xué)、免疫組化和Western b

8、lot檢測;第二部分實驗觀察紅細胞腦室內(nèi)注射的效應(yīng)，將動物分為濃縮紅細胞組(Packed RBC)和融解紅細胞組(LysedRBC)，分別將50μl濃縮紅細胞和融解紅細胞注入大鼠右側(cè)腦室，于24小時行MRI掃描并留取標本供組織學(xué)檢測;第三部分觀察去鐵敏的干預(yù)效應(yīng)，實驗動物分為去鐵敏干預(yù)組(IVH+DFX)和溶劑干預(yù)組(IVH+Veh)，分別給予右側(cè)腦室內(nèi)注入200μl自體全血，再于血液注射后2小時、6小時分別給予去鐵敏(DFX，100m

9、g/kg)或溶劑，肌肉注射，然后每12小時注射一次，共7天療程。所有動物分別于1天、3天、7天、14天和28天行MRI掃描，掃描結(jié)束后留取標本行組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果：
　　1.單側(cè)腦室注血.法成功建立大鼠實驗性IVH模型，自體血及自體抗凝血注射均導(dǎo)致明顯腦積水，至28天腦室仍顯著擴張，但抗凝血組腦積水輕于非抗凝血組;IVH引起大鼠腦鐵蓄積和HO-1、Ferritin表達升高，以及后期海馬萎縮、海馬神經(jīng)元缺失和腦室壁膠質(zhì)增生

10、。
　　2.腦室內(nèi)注射融解紅細胞導(dǎo)致急性腦室擴張、腦水腫，明顯重于濃縮紅細胞組，腦組織HO-1及OX-42免疫陽性反應(yīng)均強于濃縮紅細胞組。
　　3.去鐵敏可減輕IVH后腦室擴張和鐵蓄積，F(xiàn)erritin表達水平也相應(yīng)降低，去鐵敏干預(yù)組于IVH后28天海馬萎縮、海馬神經(jīng)元缺失均較溶劑對照組減輕。
　　結(jié)論：
　　大鼠IVH導(dǎo)致持續(xù)腦室擴張，并伴有明顯的腦鐵蓄積和鐵代謝相關(guān)蛋白表達上調(diào)，相應(yīng)地給予鐵螯合劑去鐵敏治療可

11、減輕IVH后腦積水、海馬損傷及鐵蓄積，提示鐵超載可能是IVH后腦損傷和腦積水的重要機制，去鐵敏在IVH后繼發(fā)腦損傷治療中具有的應(yīng)用前景。
　　二、大鼠腦室內(nèi)鐵離子注射模型腦損傷及米諾環(huán)素的干預(yù)研究
　　目的：
　　建立大鼠腦室內(nèi)鐵離子注射模型，觀察鐵離子腦室內(nèi)注射后的直接腦損傷效應(yīng)，探討米諾環(huán)素和巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞抑制劑(macrophage/microglial inhibitory factor，MIF)對在體條

12、件下腦室內(nèi)高鐵所致腦損傷的保護效應(yīng)及機制。
　　方法：
　　將實驗動物分成生理鹽水對照組(Saline)、氯化亞鐵組(FeCl2)、氯化亞鐵+米諾環(huán)素組(FeCl2+Minocycline)、氯化亞鐵+MIF組(FeCl2+MIF)、三氯化鐵組(FeCl3)和三氯化鐵+米諾環(huán)素組(FeCl3+Minocycline)，各組分別將上述（混合）溶液200μl注入大鼠右側(cè)腦室內(nèi)，氯化亞鐵和三氯化鐵濃度為0.5mM，米諾環(huán)素和MIF

13、濃度為1.5mM;模型建立后1天分別行MRI掃描、腦水含量測定，留取致傷后1天組織標本行Fluoro-Jade C、PANT和TUNEL檢測;分別采用鐵三嗪比色法和改良鉻天青S法檢測米諾環(huán)素對二價和三價鐵離子的螯合力。
　　結(jié)果：
　　1.氯化亞鐵腦室內(nèi)注入引起急性腦室擴張、腦水腫和神經(jīng)元變性損傷，米諾環(huán)素和MIF可明顯抑制氯化亞鐵腦室注射后所引起的小膠質(zhì)細胞活化，但僅有米諾環(huán)素能顯著降低大鼠死亡率，減輕腦水腫和神經(jīng)元損傷。

14、
　　2.三氯化鐵腦室內(nèi)注射引起顯著的急性腦室擴張和海馬神經(jīng)元變性，米諾環(huán)素能減輕神經(jīng)元損傷，但未減輕腦室擴張。
　　3.米諾環(huán)素對二價和三價鐵離子均具有螯合效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　鐵離子腦室內(nèi)注射可導(dǎo)致急性腦積水、腦水腫及神經(jīng)元損傷;米諾環(huán)素具有亞鐵和三價離子螯合力，并能顯著減輕鐵離子腦室內(nèi)注射所致的腦水腫和神經(jīng)元損傷，其神經(jīng)保護作用的機理可能與鐵螯合效力有關(guān)。
　　三、依達拉奉對大鼠腦室出血后腦損傷的干

15、預(yù)研究
　　目的：
　　觀察自由基清除劑依達拉奉對實驗性大鼠腦室出血后氧化應(yīng)激損傷、腦積水和神經(jīng)行為學(xué)損傷的干預(yù)效應(yīng)。
　　方法：
　　研究分為2部分，第一部分為急性期指標測定，動物分為生理鹽水對照組(Saline)、腦室出血+依達拉奉干預(yù)組(IVH+Edv)和腦室出血+溶劑干預(yù)組(IVH+Veh)，分別給予右側(cè)腦室內(nèi)注入200μl生理鹽水或不抗凝自體全血，注血后分別給予依達拉奉（6 mg/kg，IVH+Edv組

16、）或溶劑(IVH+Veh)皮下注射，損傷后24小時取腦組織檢測腦含水量、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性。第二部分實驗分組同前，注血組大鼠分別給予依達拉奉（6 mg／kg，IVH+Edv組）或溶劑(IVH+Veh)皮下注射共3天（注血后15分鐘，1天和2天），IVH后23天開始行為學(xué)檢測，28天行MRI掃描并留取標本行組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠IVH模型可導(dǎo)致急性腦水腫、氧化應(yīng)激及后期學(xué)習(xí)記憶功