鉛鎘聯(lián)合對(duì)新生大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損傷及NAC保護(hù)效應(yīng)的研究.pdf

1、近年來(lái)，對(duì)環(huán)境化學(xué)物毒性危害的研究已由原來(lái)單一因素為主向因素間聯(lián)合作用方向發(fā)展。鉛、鎘均是生產(chǎn)和生活中接觸頻率大、暴露范圍廣的蓄積性毒物，能對(duì)發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響。鉛、鎘單獨(dú)作用的報(bào)道較多，而對(duì)兩者的聯(lián)合毒性研究則相對(duì)較少，尤其是鉛鎘聯(lián)合對(duì)處于發(fā)育早期的動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷的系統(tǒng)研究較為罕見。本研究選用新生大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法較系統(tǒng)的探討了鉛、鎘及其聯(lián)合對(duì)新生大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損傷效應(yīng)及其

2、可能的作用機(jī)理，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)鉛、鎘及其聯(lián)合毒性作用提供理論依據(jù)。 一、體外試驗(yàn)選用新生24h內(nèi)SD大鼠作為試驗(yàn)用神經(jīng)細(xì)胞的來(lái)源，采用尼氏染色對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)鑒定和純度分析，用CCK-8法檢測(cè)了一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的活性分布，成功建立了大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的體外培養(yǎng)模型；在此基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)液中添加不同濃度的Pb、Cd，共分9組，分別為對(duì)照組、P1(Pb100μmol／L)、P2(Pb 200μmol／L)、Cl(Cd

3、 5μmol／L)、C2(Cd 10μmol／L)、P1C1(Pb100μmol／L+Cd 5μmol／L)、P1C2(Pb 100μmol／L+Cd 10μmol／L)、P2C1(Pb200μmol／L+Cd 5μmol／L)、P2C2(Pb 200μmol／L+Cd 10μmol／L)組。分別從神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、神經(jīng)細(xì)胞存活率、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率以及神經(jīng)細(xì)胞GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性和MDA含量等方面對(duì)鉛、鎘損傷新生大鼠大

4、腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了研究；同時(shí)，添加N-乙酰半胱氨酸(NAC)，觀察其在鉛鎘損傷神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中的保護(hù)效果。結(jié)果表明，①本試驗(yàn)培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)尼氏染色鑒定并計(jì)數(shù)神經(jīng)細(xì)胞純度在92％以上，且在一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)培養(yǎng)至第6d時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的OD值最高，因此，本試驗(yàn)將第6d確定為鉛鎘處理神經(jīng)細(xì)胞的時(shí)間；②與對(duì)照組相比，鉛、鎘及其聯(lián)合均能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、網(wǎng)絡(luò)減少或消失；能使胞體短直徑和突起長(zhǎng)度顯著變小和縮短(P<0.05)；使神經(jīng)細(xì)胞的存

5、活率顯著下降(P<0.05)，且具有明顯的時(shí)間與劑量效應(yīng)；各染毒組神經(jīng)細(xì)胞核皺縮、呈新月形、染色質(zhì)致密濃染，甚至出現(xiàn)核碎裂，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與相應(yīng)單獨(dú)染毒組比較，各聯(lián)合染毒組上述指標(biāo)變化更為嚴(yán)重，P1C2組較P2C1組改變明顯，其中以P2C2組最為顯著(P<0.05)；③與對(duì)照組比較，各染毒組神經(jīng)細(xì)胞GSH-Px、SOD、TChE活性均顯著下降(P<0.05)，而CAT活性和MDA含量則顯著升高(P<0.05)；④在

6、NAC拮抗鉛、鎘及其聯(lián)合毒性試驗(yàn)中，可以看出NAC能使神經(jīng)細(xì)胞存活率升高、細(xì)胞凋亡率下降，能使GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性升高及MDA含量下降，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 由上述試驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論：①鉛、鎘及其聯(lián)合能使神經(jīng)細(xì)胞胞體變小，神經(jīng)細(xì)胞突起變短，神經(jīng)細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)連接減少；能使神經(jīng)細(xì)胞存活率下降，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加，且具有明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)。鉛鎘聯(lián)合表現(xiàn)協(xié)同毒性效應(yīng)，其中鎘在聯(lián)合作用中發(fā)揮主導(dǎo)作用

7、；②鉛、鎘及其聯(lián)合能顯著改變神經(jīng)細(xì)胞GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性和MDA含量，因此，鉛、鎘的神經(jīng)系統(tǒng)毒性與其脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有關(guān)；③添加NAC可以提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率，減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，增加GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性，減少M(fèi)DA的生成，說(shuō)明NAC具有一定的拮抗鉛、鎘毒性損傷的作用，但保護(hù)效果不明顯。二、體內(nèi)試驗(yàn) 35只懷孕母鼠被隨機(jī)分為7組，分別為對(duì)照組(飲用蒸餾水)、鉛組(300mg／L)、鉛+NAC組(

8、300mg／L+20mmol／L)、鎘組(10mg／L)、鎘+NAC組(10mg／L+20mmol／L)、鉛鎘聯(lián)合組(300mg／L+10mg／L)、鉛鎘聯(lián)合+NAC組(300mg/L+10mg／L+20mmol／L)。經(jīng)飲水染毒，染毒時(shí)間為整個(gè)妊娠期，待分娩后觀察并記錄：①鉛、鎘及其聯(lián)合對(duì)新生鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響；②用光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察新生鼠大腦皮質(zhì)組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化；③測(cè)定新生鼠腦組織GSH-Px、SOD、CAT、T

9、ChE活性及MDA含量；④ICP-MS檢測(cè)了新生鼠體內(nèi)主要微量元素Cu、Fe、Zn、Mn及Se含量；⑤FQ-PCR法檢測(cè)了凋亡基因bcl-2、Bax和c-fos在新生鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)；免疫組織化學(xué)和FQ-PCR法檢測(cè)了MT-3在新生鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)研究；⑥同時(shí)進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的NAC保護(hù)試驗(yàn)研究。結(jié)果表明，①與對(duì)照組比較，各染毒組新生鼠體重和腦重均明顯下降(P<0.05或P>0.05)，其中以鉛鎘聯(lián)合組降低最為明顯；②新生鼠大腦皮質(zhì)組

10、織經(jīng)HE染色未見明顯異常的病理組織學(xué)變化，但超微結(jié)構(gòu)變化明顯，表現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞核固縮、變形，染色質(zhì)邊聚、輕度溶解，線粒體腫脹、嵴部分或完全消失，鉛鎘聯(lián)合對(duì)新生鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的損傷較鉛、鎘單獨(dú)時(shí)嚴(yán)重；③各染毒組新生鼠體內(nèi)微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，以鉛鎘聯(lián)合組降低最為明顯；④與對(duì)照組相比，鉛、鎘及其聯(lián)合均使新生鼠腦組織GSH-Px、SOD、TChE、CAT。活性下降及MDA含量升高(P<0.0

11、5或P>0.05)；⑤各染毒組新生鼠大腦皮質(zhì)bcl-2基因的表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05或P>0.05)，而Bax、c-fos和MT-3表達(dá)則顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；⑥NAC保護(hù)組與相應(yīng)染毒組比較，新生鼠體內(nèi)微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量均有所升高(P<0.05或P>0.05)，腦組織GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性均有不同程度升高但差異不顯著(P>0.05)，MDA含量則顯著下降(P<0.05)，大腦皮質(zhì)

12、bcl-2基因的表達(dá)量明顯增加(P<0.05或P>0.05)，而Bar和c-fos表達(dá)則顯著減少(P<0.05)。 通過(guò)對(duì)本部分試驗(yàn)結(jié)果的分析，可得出以下結(jié)論：①母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露能明顯減輕新生鼠體重和腦重，導(dǎo)致新生鼠腦發(fā)育遲緩；②母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露對(duì)新生鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)有顯著影響，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核固縮、變形，線粒體腫脹、嵴部分或完全消失；③鉛、鎘及其聯(lián)合導(dǎo)致機(jī)體抗氧化酶活性降低可能與其微量元素Cu、

13、Fe、Zn、Mn和Se含量下降有關(guān)；④鉛、鎘及其聯(lián)合誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與bcl-2、Bax、c-fos基因的異常表達(dá)有關(guān)，鉛鎘聯(lián)合表現(xiàn)協(xié)同毒性效應(yīng)；⑤母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露的同時(shí)添加NAC可以提高新生鼠體重和腦重，新生鼠體內(nèi)微量元素的含量增加，使新生鼠腦組織內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性升高，MDA含量顯著降低，能增加bcl-2的表達(dá)量、減少Bax、c-fos和MT-3的表達(dá)量，表明NAC對(duì)鉛、鎘毒性損傷具有一定的保護(hù)