KLD-12多肽-TGF-β1納米纖維凝膠對纖維環(huán)細(xì)胞增殖、表型及功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)旨在探究KLD-12多肽/TGF-β1納米纖維凝膠在體外實(shí)驗(yàn)中對兔纖維環(huán)細(xì)胞增殖、表型及功能的影響，尋找修復(fù)椎間盤退變的理想種子細(xì)胞、細(xì)胞支架及生長因子。
　　方法：
　　胰蛋白酶消化法提取6月齡新西蘭大白兔腰椎纖維環(huán)內(nèi)層細(xì)胞，體外培養(yǎng)至第3代，與KLD-12多肽納米纖維凝膠及TGF-β1復(fù)合，制備KLD-12多肽/TGF-β1/纖維環(huán)細(xì)胞納米纖維凝膠（實(shí)驗(yàn)組）和KLD-12多肽/纖維環(huán)細(xì)胞納米纖維凝

2、膠（對照組），體外培養(yǎng)14 d。倒置顯微鏡觀察凝膠內(nèi)細(xì)胞形態(tài)變化；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell count kit8，CCK-8）法檢測細(xì)胞增殖活性；鈣黃綠素（Calcein-AM）/碘化丙啶（PI）雙熒光染色觀察凝膠內(nèi)活細(xì)胞與死亡細(xì)胞，并計(jì)算活細(xì)胞比率；阿爾新藍(lán)法檢測培養(yǎng)基中葡萄糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）含量；免疫熒光染色觀察Ⅱ型膠原分泌情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative P

3、CR，RT-qPCR）檢測纖維環(huán)細(xì)胞中Ⅱ型膠原及聚蛋白多糖（Aggrecan）基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　（1）倒置顯微鏡觀察復(fù)合于凝膠中的纖維環(huán)細(xì)胞呈圓形，少部分在凝膠邊緣處貼壁生長的細(xì)胞呈多角型或長梭型。
　?。?）CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞增殖活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長呈非直線性增加趨勢，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性高于對照組（P<0.05）。
　?。?）Calcein-AM/PI雙熒光染色觀察示

4、：培養(yǎng)14d后，實(shí)驗(yàn)組和對照組凝膠內(nèi)細(xì)胞活細(xì)胞比率分別97.44％±0.86%和94.04%±3.27%，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）GAG檢測示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分泌GAG含量隨培養(yǎng)天數(shù)增加呈非直線上升，8 d達(dá)平臺期；對照組GAG含量隨時(shí)間上升至第8d達(dá)峰值，隨后含量下降。第5、8d實(shí)驗(yàn)組GAG含量較對照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），第11、14d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組GAG含量較對照組分泌穩(wěn)定，且具有顯著性差

5、異(P<0.01)。
　?。?）免疫熒光染色示實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞中II型膠原正常分泌，實(shí)驗(yàn)組中II型膠原含量顯著高于對照組（P<0.01）。
　?。?）RT-qPCR檢測示，實(shí)驗(yàn)組及對照組凝膠內(nèi)纖維環(huán)細(xì)胞均可見II型膠原和Aggrecan基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組II型膠原及Aggrecan mRNA相對表達(dá)量均顯著高于對照組（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　KLD-12多肽/TGF-β1納米纖維凝膠具有生物活性，且可促