還原型谷胱甘肽對大刀肝纖維化TIMP-1、TGF-β1表達影響的實驗研究.pdf

1、目的：肝纖維化是一類嚴重危害人類健康的疾病，是多種慢性肝損傷的共同后果，如果不加以控制及治療，則會進一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。正常情況下，肝纖維化促進因子與抑制因子之間存在著動態(tài)平衡，彼此互相制約，肝功能保持穩(wěn)定。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，活化的HSC通過旁分泌和自分泌作用合成并分泌多種細胞外基質(zhì)(extracellular matrixes，ECM)，同時合成并且釋放

2、大量金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)，抑制膠原酶、明膠酶等基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，減少了ECM的降解，從而導(dǎo)致ECM合成大于降解，最終導(dǎo)致過量ECM積聚在肝內(nèi)形成肝纖維化。金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)和轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowth factor，TGF)-β1是目前已知最重要的促肝纖維化因子，TGF-β1是在肝纖維化啟動、進

3、展乃至肝硬化形成中起核心作用的細胞因子，是激活肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)并促進其分泌ECM的關(guān)鍵因素，TIMP-1與肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，在肝纖維化形成過程中起到重要的作用，它可通過抑制MMP1、MMP3對Ⅰ、Ⅲ型膠原的降解，來促進肝纖維化形成。缺氧是各器官組織細胞最常見的源頭損傷因子之一，也是常見的協(xié)同損傷因子，大量實驗證明，缺氧促進了肝纖維化的形成和進一步發(fā)展，炎癥反應(yīng)及自由基損傷貫穿

4、肝纖維化的始終。還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)作為生物體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)中的重要物質(zhì)，對生物體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基能高效率的清除。并且作為體內(nèi)最重要的生物抗氧化劑，其在維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定以及細胞膜的保護方面亦起到相當重要的作用。對于肝臟這個人體的“代謝工廠”，還原型谷胱甘肽在改善肝功能、恢復(fù)肝臟酶的活性、保護肝細胞膜及解除外源性有毒物質(zhì)毒性的功效方面，發(fā)揮著非常積極的作用，GSH現(xiàn)已在臨

5、床上被廣泛應(yīng)用。雖然如此，但其作用機制尚不十分清楚。本研究以還原型谷胱甘肽作為人工干預(yù)手段，通過實驗證實其在人工誘導(dǎo)下的肝纖維化進程中對TIMP-1及TGF-β1表達的影響，以期對治療肝纖維化增加新的思路和方法。
　　方法：⑴實驗動物：健康♂ Wistar大鼠110只隨機分為3組：包括正常對照組30只及模型組40只及藥物干預(yù)組40只。正常對照組，即腹腔內(nèi)注射生理鹽水，2次/周，劑量2ml/Kg；模型組，即腹腔內(nèi)同時間點注射四氯化碳

6、，2次/周，劑量2ml/Kg；藥物干預(yù)組，除在模型組注藥基礎(chǔ)上，另腹腔內(nèi)注射GSH，1次/日，劑量50mg/Kg，分別在注射藥物第1周、第2周、第4周、第8周、第12周時間點隨機選取6只大鼠處死。分別取部分大鼠肝組織以中性甲醛溶液固定、石蠟包埋，多聚賴氨酸涂布的載玻片制作4μm組織病理切片，用于HE染色及免疫組化。⑵檢測指標：HE染色觀察肝臟組織的病理學(xué)變化，觀察大鼠肝纖維化的程度，利用免疫組化染色方法分別檢測不同組別及各時間點肝大鼠纖

7、維化中TGF-β1及TIMP-1的表達情況。⑶數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析：陽性指數(shù)檢測值以均數(shù)±標準差表示，分別在同時間不同組別間采取單因素方差分析，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：①大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變：模型組大鼠肝內(nèi)均出現(xiàn)明顯纖維化，隨時間延長，纖維化程度逐漸增強，纖維組織延伸形成完全或不完全分割的纖維間隔。藥物干預(yù)組在肝纖維化程度上較模型組減輕，多數(shù)小葉結(jié)構(gòu)清晰，纖維組織僅少量增生。

8、②免疫組化TGF-β1及TIMP-1表達：正常肝組織內(nèi)偶可見TGF-β1及TIMP-1表達，模型組及藥物干預(yù)組隨著纖維化進程進展，肝纖維化程度加重，TGF-β1及TIMP-1表達亦逐漸明顯，表達數(shù)量及表達空間擴大，但藥物干預(yù)組較模型組明顯減輕。染色陽性指數(shù)比較三組在不同周次間TGF-β1，TIMP-1的差別，除第一周對照組與干預(yù)組無差別外，其余各組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：TIMP-1及TGF-β1在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維