TGF-β1和核心蛋白多糖對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖和熱休克蛋白47基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 青光眼是一種嚴(yán)重致盲性眼病，降低眼內(nèi)壓是青光眼治療的一個(gè)主要措施，濾過(guò)性手術(shù)具有較好的降壓效果，目前被認(rèn)為是控制眼壓最有效的方法，然而由于創(chuàng)傷修復(fù)愈合，濾過(guò)口部位成纖維細(xì)胞增殖和膠原形成，可導(dǎo)致濾過(guò)通道閉合，嚴(yán)重影響青光眼濾過(guò)性手術(shù)的成功率。針對(duì)青光眼手術(shù)后瘢痕的形成，目前主要的對(duì)抗手段是術(shù)中術(shù)后采用抗瘢痕藥物，臨床上應(yīng)用較廣泛的是絲裂霉素C(MMC)和5．氟尿嘧啶(5-FU)，這兩種抗代謝藥物的應(yīng)用顯著地提高了青光

2、眼濾過(guò)性手術(shù)的成功率，但是也不可避免損傷鄰近眼部組織，對(duì)結(jié)膜、角膜、鞏膜、睫狀體、小梁網(wǎng)等組織都有一定的毒副作用。尋找一種療效高、特異性強(qiáng)、毒副作用小的抗瘢痕藥物已成為近年來(lái)青光眼研究的熱點(diǎn)。 熱休克蛋白47(HSP47)是一種分子量為47KD的蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中能與多種類型膠原和前膠原特異性結(jié)合，HSP47作為膠原合成有關(guān)的“分子伴侶”，參與前膠原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊、裝配、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程，對(duì)膠原分子合成質(zhì)量控制起重要的作用，能夠

3、防止錯(cuò)誤構(gòu)型的前膠原分泌出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。HSP47在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中表達(dá)增強(qiáng)，且在全身部分纖維化疾病病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)能促進(jìn)全身許多纖維組織HSP47的表達(dá)，青光眼濾過(guò)手術(shù)失敗主要因?yàn)槟z原的增殖。尚不清楚，TGF-β1能否通過(guò)促進(jìn)Tenon囊成纖細(xì)胞增殖和促進(jìn)HSP47和I型膠原表達(dá)，導(dǎo)致膠原的大量產(chǎn)生，促進(jìn)正常Tenon囊成纖維細(xì)胞纖維化，本實(shí)驗(yàn)首次研究HSP47在青光眼濾過(guò)手術(shù)后Tenon囊成

4、纖維細(xì)胞的表達(dá)，同時(shí)研究TGF-β1抑制劑核心蛋白多糖(Decorin)能否有效抑制Tenon囊成纖細(xì)胞HSP47和I型膠原mRNA表達(dá)，探討青光眼濾過(guò)手術(shù)后瘢痕形成可能的分子機(jī)理及其可能的對(duì)抗手段。 目的： 體外培養(yǎng)Tenon囊成纖維細(xì)胞，研究TGF-β1和Decorin對(duì)體外培養(yǎng)的Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖、HSP47及膠原基因表達(dá)水平的影響；研究青光眼濾過(guò)手術(shù)區(qū)域Tenon囊成纖維細(xì)胞HSP47和膠原纖維的表達(dá)；研

5、究Decorin對(duì)濾過(guò)手術(shù)區(qū)域Tenon囊成纖維細(xì)胞HSP47和膠原纖維表達(dá)的影響；探討HSP47在青光眼濾過(guò)手術(shù)后瘢痕形成中的作用，以及Decorin抗瘢痕形成的分子機(jī)理。 方法： 1．取新近發(fā)病的需要手術(shù)的青光眼患者的Tenon囊組織，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人Tenon囊成纖維細(xì)胞。 2．不同濃度的TGF-β1和Decorin對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞作用不同時(shí)間，MTT比色法檢測(cè)二者對(duì)Tenon囊成纖維

6、細(xì)胞增殖的影響。 3．以不同濃度的TGF-β1和Decorin對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞作用不同時(shí)間，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞I型膠原纖維和HSP47的基因表達(dá)的影響。 4．兔眼濾過(guò)手術(shù)制作抗青光眼手術(shù)動(dòng)物模型，18只兔(36眼)隨機(jī)分組，16只兔(32眼)左眼均為對(duì)照組，右眼均為實(shí)驗(yàn)組，2只兔(4眼)不做手術(shù)為正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均行濾過(guò)手術(shù)，實(shí)驗(yàn)組分別于術(shù)備、術(shù)后1d、3d球結(jié)膜下注射

7、Decorin,對(duì)照組在相同的時(shí)間球結(jié)膜注射BSS，術(shù)后觀察結(jié)膜傷口愈合，結(jié)膜充血，濾過(guò)泡大小，角膜透明度，前房反應(yīng)，晶狀體透明度，眼壓，分別于手術(shù)后第5d、7d、15d、30d分批處死兔子，每次4只，完整取下眼球，4％甲醛固定液固定72h，免疫組織化學(xué)檢測(cè)Decorin對(duì)濾過(guò)手術(shù)區(qū)HSP47和膠原纖維表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1．體外成功培養(yǎng)Tenon囊成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，形狀穩(wěn)定，細(xì)胞經(jīng)過(guò)冷凍與復(fù)蘇后，仍能保

8、持其原來(lái)的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定的生物學(xué)特性。 2．lng/ml及以上濃度的TGF-β 1可促進(jìn)Tenon囊成纖維細(xì)胞的增殖，并與濃度成正比；1μg／ml及以上濃度的Decorin對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用，抑制作用與濃度成正比；Decorin能抑制TGF-β 1促Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖作用，其抑制作用呈劑量依賴性。 3．lng／ml及以上濃度的TGF-β 1促進(jìn)Tenon囊成纖維細(xì)胞HSP47和Ⅰ型膠原

9、纖維mRNA表達(dá)，作用呈劑量依賴性。5ng/ml TGF-β 1刺激Tenon囊成纖維細(xì)胞不同時(shí)間后，HSP47和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，48hHSP47和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)達(dá)高峰，HSP47 mRNA表達(dá)為對(duì)照組的2.945倍，Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)為對(duì)照組的3.140倍。 4．Decorin能抑制TGF-β 1誘導(dǎo)Tenon囊成纖維細(xì)胞HSP47和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)，不同濃度的Decorin(0.01～5μg/ml

10、)和5ng/ml的TGF-β1混合，1μg／ml及以上濃度的Decorin對(duì)TGF-βl誘導(dǎo)Tenon囊成纖維細(xì)胞的HSP47和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)有抑制作用。 5．Decorin能預(yù)防青光眼濾過(guò)手術(shù)后瘢痕的形成，有效降低濾過(guò)手術(shù)后眼壓，能形成良好的濾過(guò)泡，沒(méi)有明顯的眼部并發(fā)癥。實(shí)驗(yàn)組眼壓能較長(zhǎng)時(shí)間的維持在低于正常眼壓水平，術(shù)后30d濾過(guò)泡隆起、彌散，大部分為功能性濾泡，而對(duì)照組局限、平坦、面積小，全為非功能性濾過(guò)泡。 6．免

11、疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HSP47在青光眼濾過(guò)手術(shù)后的表達(dá)，對(duì)照組在濾過(guò)手術(shù)后5dHSP47表達(dá)增加，在7dHSP47表達(dá)達(dá)到峰值，術(shù)后15dHSP47表達(dá)逐漸下降，但仍明顯高于術(shù)前水平且維持到術(shù)后30d，而實(shí)驗(yàn)組結(jié)膜濾過(guò)泡免疫組化染色稀疏、密度低，HSP47的表達(dá)弱陽(yáng)性，術(shù)后第5d，7d，15d、30dHSP47表達(dá)明顯低于同時(shí)期的對(duì)照組。 7．天狼星玫瑰紅染色組織切片檢測(cè)濾過(guò)術(shù)后Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維變化規(guī)律，對(duì)照組可見(jiàn)大量的Ⅰ型和Ⅲ

12、型膠原纖維，且緊密排列，隨著手術(shù)后觀察時(shí)間越長(zhǎng)，Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的密度越大，30d膠原纖維的密度最高。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維排列稀疏、密度較低，相同時(shí)期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較，Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維密度有顯著性差異，Decorin可以抑制HSP47的表達(dá)和膠原纖維合成，減少局部組織纖維化。 結(jié)論： 1．TGF-β1能促進(jìn)Tenon囊成纖維細(xì)胞的增殖，并刺激Tenon囊成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)HSP47和Ⅰ型膠原基因的表達(dá)，TGF-β

13、1刺激成纖維細(xì)胞增殖的作用可能與青光眼濾過(guò)術(shù)后濾過(guò)道瘢痕化有關(guān)。 2．Decorin能抑制Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖、抑制HSP47和膠原基因的表達(dá)，可以通過(guò)與受體結(jié)合，直接干擾TGF-β1的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響HSP47和膠原基因的表達(dá)，并可通過(guò)此機(jī)制發(fā)揮其在青光眼術(shù)后抗瘢痕作用。 3．青光眼濾過(guò)術(shù)后HSP47和TGF-β1的表達(dá)規(guī)律基本一致，機(jī)制可能是青光眼濾過(guò)術(shù)后高表達(dá)的TGF-β1作用于HSP47的順式作用原件，進(jìn)