PARP-1在苯并芘誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化表遺傳改變中的作用.pdf

1、研究背景：近年來，表觀遺傳學(xué)(epigenetics)已成為生命科學(xué)中普遍關(guān)注的前沿學(xué)科。表觀遺傳學(xué)是與遺傳學(xué)(genetics)相對(duì)應(yīng)的概念。在人類基因組中含有兩類信息：一類是傳統(tǒng)意義上的遺傳學(xué)信息，它提供了合成生命所必需的所有蛋白質(zhì)的模板；另一類是表觀遺傳學(xué)信息，它提供了何時(shí)、何地及如何應(yīng)用遺傳學(xué)信息的指令，以確保基因適當(dāng)?shù)亻_關(guān)。遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而表觀遺傳學(xué)則

2、是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化。表觀遺傳學(xué)研究主要涉及DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質(zhì)重塑以及MicroRNA、SiRNA等。大量研究表明表觀遺傳學(xué)異常與人類多種疾病密切相關(guān)，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，表觀遺傳學(xué)改變更是起重要作用。多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)是較早認(rèn)識(shí)到的DNA損傷感應(yīng)及監(jiān)測分子，是最早發(fā)現(xiàn)的PARP超家族成員，也是至今研究

3、得最多的一個(gè)。它廣泛存在于真核細(xì)胞中，是一類重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)90％的聚ADP-核糖基聚合體合成。從PARP-1發(fā)現(xiàn)至今的短短四十余年中，該酶一直是分子生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)之一。隨著研究的不斷深入，已經(jīng)證明，PARP參與許多重要的生命活動(dòng)如凋亡、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞死亡、染色體功能、基因組完整性和DNA甲基化等，PARP-1抑制劑在糖尿病、急慢性炎癥、出血性休克及心臟、腎、腸的缺血再灌注損傷等的治療中也發(fā)揮重要作用。

4、
　　 目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立人支氣管上皮細(xì)胞16HBE的PARP-1基因缺陷細(xì)胞株，動(dòng)態(tài)觀察BaP誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的表觀遺傳改變，并探討PARP-1在表觀遺傳改變中的作用，為闡明PARP-1參與BaP引起表觀遺傳改變的分子機(jī)制和尋找BaP致癌過程中早期敏感的生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)，為化學(xué)致癌的防治提供新的思路。
　　 方法：
　　 ⑴應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建人支氣管上皮細(xì)胞(1

5、6HBE)的PARP-1缺陷細(xì)胞株(16HBE-shPARP1)，作為本研究的工具細(xì)胞；同時(shí)比較兩種細(xì)胞的一般生物學(xué)特性(包括生長狀況、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞周期等)。
　　 ⑵分別以1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和30.0μmol/L的BaP處理16HBE和16HBE-shPARP1細(xì)胞12h和24h，用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測兩種細(xì)胞的DNA損傷程度；再將BaP處理24h后的兩組細(xì)胞分別恢復(fù)培養(yǎng)12h和24h，用單細(xì)胞凝

6、膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測其損傷DNA恢復(fù)情況。
　　 ⑶分別以1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和30.0μmol/L BaP處理16HBE和16HBE-shPARP1細(xì)胞72h，以5-甲基胞嘧啶細(xì)胞免疫熒光和高效毛細(xì)管電泳法檢測各處理組細(xì)胞基因組DNA整體甲基化水平；同時(shí)以基于ELISA樣反應(yīng)和生物素標(biāo)記底物NAD+法檢測胞內(nèi)總體甲基轉(zhuǎn)移酶和PARP酶活性，并以RT-Q-PCR和Western Blotting檢測PARP-1和

7、甲基化相關(guān)酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 ⑷以40.0μmol/L BaP誘導(dǎo)處理16HBE細(xì)胞24h，隨后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代，每周誘導(dǎo)處理一次；每隔三周取細(xì)胞做軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，鑒定細(xì)胞的惡性程度，最終以BaP誘導(dǎo)18周后惡性轉(zhuǎn)化的16HBE細(xì)胞為誘導(dǎo)終點(diǎn)，簡稱為BTC。
　　 ⑸以RT-Q-PCR和Western Blotting分別檢測BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化各階段細(xì)胞PARP-

8、1和腫瘤相關(guān)基因p53及k-ras的mRNA和蛋白表達(dá)水平；在亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA的基礎(chǔ)上，以MSP檢測上述各基因啟動(dòng)子區(qū)特異位點(diǎn)的甲基化狀況；同時(shí)對(duì)各階段細(xì)胞的PARP-1和p53啟動(dòng)子區(qū)的CpG島進(jìn)行克隆測序，全面觀察目的基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾狀況。
　　 ⑹以細(xì)胞免疫熒光法檢測各階段細(xì)胞組蛋白H3、H4整體乙?；?；同時(shí)以基于ELISA樣反應(yīng)檢測胞內(nèi)總體組蛋白去乙?；傅幕钚裕T-Q-PCR和Western B

9、lotting檢測組蛋白去乙酰化酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 ①16HBE和16HBE-shPARP1細(xì)胞經(jīng)BaP染毒處理后，其DNA損傷的程度均呈劑量、時(shí)間依賴性加劇；對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行平行比較發(fā)現(xiàn)，染毒劑量和染毒時(shí)間一定時(shí)，16HBE-shPARP1細(xì)胞的各損傷指標(biāo)均明顯高于16HBE細(xì)胞，PARP-1基因的沉默可加重BaP引起的16HBE細(xì)胞DNA損傷程度。
　　 ②利用5mdC抗體進(jìn)行細(xì)胞

10、免疫熒光實(shí)驗(yàn)，從形態(tài)學(xué)上觀察細(xì)胞基因組DNA甲基化的定位并比較各處理組之間平均熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，與16HBE細(xì)胞相比，16HBE-shPARP1細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯增高。兩種細(xì)胞經(jīng)BaP染毒處理72h后，隨著染毒劑量的增加，各處理組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值均呈略增高后逐漸降低的趨勢(shì)；當(dāng)染毒劑量為30.0μmol/L時(shí)，16HBE和16HBE-shPARP1細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值顯著降低。
　　 ③16HBE及16HBE-

11、shPARP1細(xì)胞經(jīng)BaP處理72h后，隨著BaP染毒劑量的增加，兩種細(xì)胞胞內(nèi)PARP酶活性及PARP-1的mRNA、蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)先增高后降低的一致趨勢(shì)，16HBE-shPARP1細(xì)胞各處理組普遍顯著低于16HBE細(xì)胞組。于最高染毒劑量組30.0μmol/L時(shí)，兩種細(xì)胞的PARP-1表達(dá)水平下降顯著。
　　 ④5mdC甲基化免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，與正常16HBE細(xì)胞相比，隨著BaP

12、誘導(dǎo)時(shí)間的延長，各階段細(xì)胞基因組DNA整體甲基化水平逐漸降低。用HPCE進(jìn)一步進(jìn)行定量檢測發(fā)現(xiàn)，正常16HBE細(xì)胞中平均mCpG％值約為4.78％，隨著BaP誘導(dǎo)時(shí)間的延長，六個(gè)階段細(xì)胞的mCpG％值分別為4.62±0.39％、3.82±0.39％、4.07±0.40％、3.27±0.31％、2.63±0.21％和2.48±0.15％；BTC細(xì)胞經(jīng)DAC處理72h后，其mCpG％值進(jìn)一步下降為2.11±0.09％。
　　 ⑤16

13、HBE細(xì)胞經(jīng)BaP誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化過程中，隨著BaP誘導(dǎo)處理時(shí)間的延長，16HBE細(xì)胞中PARP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均逐漸增高，并在BTC細(xì)胞中表達(dá)水平達(dá)到最高。對(duì)癌基因k-ras和抑癌基因p53進(jìn)行表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著16HBE細(xì)胞惡性程度的增加，k-ras表達(dá)逐漸增高，其中，BTC細(xì)胞中k-ras基因的表達(dá)量為正常對(duì)照組16HBE細(xì)胞的8倍以上；而p53的表達(dá)水平則呈逐漸降低的趨勢(shì)，并于BTC細(xì)胞中降低最顯著。
　　 ⑥細(xì)

14、胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，隨著BaP誘導(dǎo)時(shí)間的延長，與正常對(duì)照組16HBE細(xì)胞相比，誘導(dǎo)各階段細(xì)胞的組蛋白H3、H4整體乙?；骄手饾u降低的趨勢(shì)，而組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA處理可抑制BTC細(xì)胞組蛋白H3、H4乙?；降慕档挖厔?shì)。利用ELISA樣反應(yīng)對(duì)胞內(nèi)總體組蛋白去乙?；傅幕钚赃M(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，各階段細(xì)胞中總體組蛋白去乙?；富钚猿手饾u升高的趨勢(shì)；具體來看，與正常對(duì)照組16HBE細(xì)胞相比，六階段細(xì)胞中HDACs活性

15、分別增高了18.3％、35.0％、49.6％、53.3％、54.8％和83.6％。采用RT-Q-PCR和Western Blotting對(duì)HDACs表達(dá)水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，隨著BaP誘導(dǎo)處理時(shí)間的延長，HDAC-1和HDAC-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均逐漸增高，并于BTC細(xì)胞中增高顯著；TSA處理均能降低BTC細(xì)胞中HDAC-1和HDAC-2的表達(dá)水平。HDAC-3在各階段細(xì)胞中的表達(dá)水平變化并不明顯。
　　 結(jié)論：
　　

16、 ⑴利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)成功構(gòu)建人支氣管上皮細(xì)胞的PARP-1基因缺陷細(xì)胞株，沉默效果顯著且穩(wěn)定性好，為后續(xù)PARP-1基因功能研究提供了有效的工具細(xì)胞。
　　 ⑵PARP-1缺陷可增加16HBE細(xì)胞對(duì)BaP的敏感性，PARP-1對(duì)BaP引起16HBE細(xì)胞DNA損傷的早期修復(fù)至關(guān)重要。
　　 ⑶PARP-1對(duì)胞內(nèi)DNMT-1的活性具有抑制效應(yīng)，且這種效應(yīng)隨著PARP-1的缺失而緩解；PARP-1所催化的ADP核

17、糖基化反應(yīng)可通過抑制DNMT-1的酶活性來調(diào)節(jié)BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞DNA甲基化水平改變。
　　 ⑷BaP誘發(fā)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，基因組DNA整體甲基化水平逐漸降低，使得基因組的不穩(wěn)定性增強(qiáng)，這是引發(fā)多種遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變的積累，是最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的早期驅(qū)動(dòng)力。
　　 ⑸BaP誘發(fā)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，PARP-1和癌基因k-ras表達(dá)顯著上調(diào)，抑癌基因p53表達(dá)下調(diào)，這些改變均不受基因啟動(dòng)