PARP-1抑制劑抗芥子氣損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、芥子氣（Sulfur mustard，SM）是一種糜爛性化學(xué)戰(zhàn)劑，曾在第一次、第二次世界大戰(zhàn)及兩伊戰(zhàn)爭(zhēng)中廣泛使用，由于其使用最多、最為普遍和傷害較大，被稱為“毒劑之王”。二戰(zhàn)后，日本遺留在中國(guó)的化學(xué)戰(zhàn)劑以SM為主，時(shí)有造成我平民傷害的報(bào)道。SM結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易合成，易被恐怖分子掌握和利用。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心2000年4月發(fā)表的關(guān)于“生化恐怖戰(zhàn)備計(jì)劃”的建議中指出，恐怖分子可能使用的毒劑包括化學(xué)戰(zhàn)劑和一般的工業(yè)毒性化合物，但最有可能使用

2、的仍然是神經(jīng)性毒劑、糜爛性毒劑和氰類毒劑。皮膚、眼及呼吸系統(tǒng)是 SM局部中毒的主要靶器官，而骨髓、造血、免疫系統(tǒng)等是SM全身中毒的主要靶器官。SM損傷的作用機(jī)理復(fù)雜，至今尚未完全闡明，且無理想的防治藥物。因此，研制作用更強(qiáng)、療效更好的新型SM防治藥物是亟待解決的主要問題之一。
　　SM是一種雙功能烷化劑，主要與細(xì)胞中的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等生物大分子發(fā)生反應(yīng)。嚴(yán)重的DNA損傷是SM導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因。SM導(dǎo)

3、致DNA損傷后，許多生化途徑被激活用于保護(hù)細(xì)胞免于死亡。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的DNA損傷修復(fù)酶。當(dāng)SM造成DNA損傷后，PARP-1被迅速激活，PARP-1通過消耗NAD+合成大量的聚腺苷二磷酸核糖(poly(ADP-ribose), pADPr)，

4、而pADPr會(huì)共價(jià)結(jié)合于PARP-1本身或其他 DNA損傷修復(fù)相關(guān)的核蛋白，從而介導(dǎo) DNA損傷修復(fù)。然而，當(dāng) PARP-1過度激活時(shí)則會(huì)大量消耗細(xì)胞內(nèi)NAD+，造成能量耗竭甚至細(xì)胞死亡。提示PARP-1的激活在SM損傷中有十分重要的作用。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1抑制劑能夠一定程度上的減輕SM造成的病理損傷，表明其在 SM損傷中有一定的治療作用。美軍研究表明 PARP-1抑制劑能夠減輕SM造成的小鼠皮膚病理損傷50％以上

5、，提示PARP-1抑制劑有望用于防治SM中毒。但也有研究表明，雖然PARP-1抑制劑能夠避免SM損傷造成的NAD+耗竭，但是對(duì)細(xì)胞存活并沒有明顯的保護(hù)作用。而且有研究表明，PARP-1抑制劑能夠減慢SM損傷后DNA的損傷修復(fù)速度。因此PARP-1抑制劑抗SM損傷的藥效以及PARP-1在SM損傷中的作用機(jī)制并不明確，有待進(jìn)一步研究和確證。
　　課題組首先合成了美軍正在研究并可能用于防治SM中毒的新型PARP-1抑制劑；另外，目前在腫

6、瘤治療的研究中，出現(xiàn)了新的一批活性及選擇性更強(qiáng)的PARP-1抑制劑，這些新的藥物抗 SM損傷的作用效果值得期待。接下來我們對(duì)以上化合物進(jìn)行了體外分子水平的PARP-1抑制活性篩選，然后選擇其中活性較強(qiáng)的化合物在細(xì)胞水平及動(dòng)物水平進(jìn)行了系統(tǒng)的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　一、PARP-1抑制劑的活性篩選及其抗SM損傷的活性評(píng)價(jià)
　　首先對(duì)化學(xué)合成獲得的BPUBA、S001、S002、S003等85個(gè)化合物進(jìn)行了體

7、外分子水平的PARP-1抑制活性篩選，進(jìn)而選擇其中活性較強(qiáng)的化合物在細(xì)胞水平及動(dòng)物水平進(jìn)行了其抗SM損傷活性的評(píng)價(jià)。
　　1.體外篩選PARP-1抑制劑的活性
　　Trevigen's Homogeneous PARP Inhibition Assay是一個(gè)利用熒光的高靈敏體外篩選PARP-1抑制劑的系統(tǒng)，本部分利用此試劑盒篩選化合物對(duì)PARP-1的抑制活性。
　　結(jié)果顯示，S001和S003及其類似物的PARP-1抑

8、制活性較高，而BPUBA、S002及其類似物對(duì) PARP-1的抑制活性較低，提示后續(xù)研究可重點(diǎn)開展活性較高的S001和S003及其類似物抗SM皮膚損傷的藥效學(xué)試驗(yàn)。
　　2.體外細(xì)胞水平的藥效評(píng)價(jià)
　　體外篩選結(jié)果表明，PARP-1抑制劑S001、S003及其類似物對(duì)PARP-1有較強(qiáng)的抑制活性，因此后續(xù)研究應(yīng)用SM損傷的永生化人表皮角化形成細(xì)胞（HaCaT）模型，對(duì)這兩個(gè)化合物及其類似物對(duì) SM損傷細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行了體外

9、藥效學(xué)評(píng)價(jià)。
　　應(yīng)用1000μM SM染毒6h和24h后，HaCaT細(xì)胞活力均顯著性降低，且隨著染毒時(shí)間增加，細(xì)胞活力降低更加明顯。S001、S003及其類似物干預(yù)后，在染毒后6h，能明顯增加細(xì)胞活力；而在染毒后24h，S001、S003等化合物雖然仍然能夠增加 SM染毒組的細(xì)胞活力，但是這種作用已逐漸降低。結(jié)果表明，以上化合物能夠顯著減輕SM導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，且在染毒后6h時(shí)的保護(hù)作用明顯優(yōu)于24h。
　　3.整體動(dòng)物水平

10、的藥效評(píng)價(jià)
　　應(yīng)用0.64mg/ear SM染毒，首先建立了小鼠耳廓SM皮膚損傷模型，繼而應(yīng)用此模型對(duì)PARP-1抑制劑進(jìn)行了整體動(dòng)物水平的藥效評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.64mg/ear SM染毒后小鼠耳廓水腫程度顯著性增加，PARP-1抑制劑S003腹腔注射能夠顯著性降低0.64mg/ear SM染毒造成的小鼠耳廓水腫，但是給藥方式改為口服或涂抹給藥時(shí)，對(duì)0.64mg/ear SM染毒造成的小鼠耳廓水腫則沒有明顯的減輕作用。結(jié)果表明

11、，S003給藥方式為腹腔注射時(shí)效果較好，但是給藥方式改為口服及涂抹時(shí)藥效不明顯。此外，我們應(yīng)用 SM染毒建立了無毛豚鼠 SM皮膚染毒模型，并觀察了PARP-1抑制劑S003的藥效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SM可以使皮膚紅腫和皮膚血流顯著性增加，腹腔注射給予PARP-1抑制劑S003后能顯著性降低SM造成的皮膚紅腫和皮膚血流增加。
　　二、PARP-1抑制劑在SM損傷中的作用及機(jī)制研究
　　綜合體外活性篩選和體內(nèi)外的藥效評(píng)價(jià)結(jié)果，確定了藥效

12、最好的PARP-1抑制劑S003，繼而在HaCaT細(xì)胞染毒模型上對(duì)其抗SM損傷的作用及其機(jī)理進(jìn)行研究，并探討了PARP-1抑制劑在SM損傷防治中的應(yīng)用價(jià)值。
　　1. PARP-1抑制劑S003對(duì)SM所致PARP-1激活的抑制作用
　　應(yīng)用熒光的高靈敏體外篩選 PARP-1抑制劑的試劑盒，檢測(cè)了活性最強(qiáng)的PARP-1抑制劑S003及經(jīng)典的PARP-1抑制劑3-AB對(duì)PARP-1的IC50值，評(píng)價(jià)了其對(duì)PARP-1的抑制作用。

13、結(jié)果表明，PARP-1抑制劑S003（IC50=60.22nM）抑制PARP-1的能力比3-AB（IC50=10.86μM）強(qiáng)180倍以上。
　　采用免疫熒光法及Western Blot方法，于100μM及1000μM SM染毒后立即給予S003，觀察SM染毒HaCaT細(xì)胞損傷模型PARP-1的活化及S003對(duì)PARP-1活化的抑制作用。結(jié)果顯示，100μM和1000μM SM染毒6h后，HaCaT細(xì)胞內(nèi)PARP-1活化產(chǎn)物pAD

14、Pr的表達(dá)均明顯增加，1000μM SM誘導(dǎo)PARP-1的活化程度明顯高于100μM SM。SM染毒后立即應(yīng)用S003可顯著降低HaCaT細(xì)胞中pADPr的表達(dá)，在1000μM SM染毒時(shí)效果最為明顯。結(jié)果提示，SM損傷可導(dǎo)致PARP-1活化，給予S003可以顯著抑制PARP-1的激活，提示S003是一個(gè)有效的PARP-1抑制劑。
　　2. PARP-1抑制劑S003對(duì)SM所致HaCaT細(xì)胞及小鼠耳廓皮膚損傷的作用
　　在H

15、aCaT細(xì)胞SM染毒模型上，觀察了SM不同染毒濃度（100μM及1000μM）染毒6h和24h后S003對(duì)細(xì)胞活力的作用。結(jié)果顯示100μM及1000μM SM可以使細(xì)胞活力顯著性降低。在染毒后6 h，給予S003顯著增加了1000μM SM染毒組的細(xì)胞活力，而對(duì)100μM SM染毒組沒有觀察到藥效。然而在染毒后24h，不論在100μM SM還是1000μM SM染毒條件下，均沒有觀察到S003保護(hù)細(xì)胞活力的作用。
　　在小鼠耳廓

16、SM染毒模型上，觀察了SM不同染毒濃度（0.16mg/ear，0.64mg/ear）染毒24h后，S003對(duì)小鼠相對(duì)耳腫程度（REW）及表皮壞死（EN）的作用。結(jié)果表明，高濃度SM染毒組（0.64mg/ear）的評(píng)分（REW204.83, EN3.9）顯著性高于低濃度SM染毒組（0.16mg/ear）的評(píng)分（REW154.67, EN2.2）。給予PARP-1抑制劑S003后，顯著性降低了高濃度SM染毒組的REW評(píng)分（26%）及EN評(píng)分

17、（40%），而對(duì)低濃度SM染毒組的評(píng)分沒有顯著性影響。采用H&E染色方法觀察SM對(duì)小鼠耳廓皮膚的損害。結(jié)果顯示，暴露于0.16mg/ear及0.64mg/ear SM后24h均會(huì)造成小鼠耳廓皮膚中度到重度的病理學(xué)改變，主要表現(xiàn)為真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、網(wǎng)狀變性及表皮基底細(xì)胞壞死，伴隨高嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核固縮。給予 S00324h后對(duì)0.64mg/ear SM造成的細(xì)胞核固縮有明顯的保護(hù)作用，而對(duì)0.16mg/ear SM造成的損傷沒

18、有明顯作用。
　　上述結(jié)果提示，PARP-1抑制劑S003在HaCaT細(xì)胞及小鼠耳廓模型上對(duì)SM損傷有一定保護(hù)作用。
　　3. PARP-1抑制劑S003對(duì)SM所致NAD+/ATP耗竭及凋亡壞死的影響
　　國(guó)際上已有體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)證明，SM染毒可以造成PARP-1的過度激活及NAD+含量的降低。我們對(duì)本研究中應(yīng)用的HaCaT細(xì)胞染毒模型上SM對(duì)NAD+/ATP的影響進(jìn)行了驗(yàn)證并考察了S003的藥效。結(jié)果提示，SM染毒會(huì)濃

19、度依賴性地降低細(xì)胞內(nèi)NAD+/ATP含量，而染毒后立即給予S003后對(duì)SM造成的NAD+/ATP含量降低有保護(hù)作用。
　　此外，SM介導(dǎo)的PARP-1的活化可能會(huì)造成細(xì)胞壞死或凋亡。因此，通過Annexin V/PI雙染實(shí)驗(yàn)觀察了SM對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死的影響并評(píng)價(jià)S003的作用。結(jié)果表明，SM能造成明顯的細(xì)胞凋亡和壞死，給予S003可顯著降低凋亡和壞死的細(xì)胞數(shù)目。
　　在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們繼續(xù)研究了S003對(duì)凋亡執(zhí)行蛋白Ca

20、spase3活力的影響，以及S003對(duì)重要的凋亡信號(hào)也就是Caspase3切割PARP-1的產(chǎn)物c-PARP表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，染毒后6h，隨著SM濃度的增加，Caspase3的活性及c-PARP的表達(dá)也顯著增加，而染毒后立即給予S003會(huì)顯著性降低高濃度SM（1000μM SM）染毒造成Caspase3的激活及c-PARP的表達(dá)，而對(duì)低濃度SM染毒（100μM SM）造成的Caspase3的激活及 c-PARP的表達(dá)沒有顯著性降低作

21、用；染毒后24h， Caspase3的活性及c-PARP的表達(dá)亦顯著性增加，S003能夠顯著性降低100μM及1000μM SM造成Caspase3激活，而對(duì)c-PARP沒有明顯的作用。
　　上述結(jié)果提示，PARP-1抑制劑S003對(duì)高濃度SM染毒細(xì)胞具有保護(hù)作用，主要原因可能在于減輕了SM染毒造成的嚴(yán)重的NAD+/ATP耗竭及凋亡壞死。S003對(duì)低濃度SM所致的細(xì)胞損傷沒有保護(hù)作用，原因可能在于低濃度SM染毒對(duì)細(xì)胞損傷較輕，NA

22、D+/ATP消耗及凋亡壞死程度較輕。
　　4. PARP-1抑制劑S003對(duì)SM所致DNA損傷的影響
　　當(dāng)DNA發(fā)生斷裂，DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks, DSBs）的敏感標(biāo)志物H2AX會(huì)在其Ser139位形成磷酸化，H2AX磷酸化的程度與DNA損傷程度密切相關(guān)。我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中H2AX在Ser139位的磷酸化程度，研究SM對(duì)DNA損傷的影響及S003的作用。結(jié)果表明

23、，染毒后6h和24h SM會(huì)顯著性增加H2AX的磷酸化。而S003在染毒后6h對(duì)H2AX的磷酸化沒有明顯作用，在染毒后24h進(jìn)一步增加了SM造成的H2AX磷酸化。這一結(jié)果表明PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的DNA斷裂。
　　三、PARP-1敲降對(duì)SM損傷后HaCaT細(xì)胞的影響
　　采用RNA干擾的方法，敲降HaCaT細(xì)胞中的PARP-1，深入研究PARP-1在SM損傷中的作用，具體結(jié)果如下。
　　1. PAR

24、P-1敲降效率的確定及對(duì)SM損傷后HaCaT細(xì)胞活力的影響
　　通過檢測(cè)RNA干擾后，HaCaT細(xì)胞中PARP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白含量，確定PARP-1在HaCaT細(xì)胞上的敲降效率。結(jié)果表明，PARP-1敲降效率較高，能夠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過檢測(cè)PARP-1敲降對(duì)SM染毒后HaCaT細(xì)胞活力的影響，研究PARP-1敲降對(duì)SM所致細(xì)胞毒性的作用。結(jié)果表明，PARP-1敲降能夠增加細(xì)胞活力，減輕SM所致的細(xì)胞毒性。
　　2

25、. PARP-1敲降對(duì)SM損傷后HaCaT細(xì)胞凋亡通路的影響
　　通過檢測(cè)內(nèi)源性凋亡途徑的信號(hào)p-JNK、p-p53、Caspase9、外源性凋亡途徑的信號(hào)Caspase8、凋亡蛋白c-PARP的生成和Caspase3的激活，研究SM染毒后細(xì)胞凋亡情況及PARP-1敲降對(duì)SM損傷后HaCaT細(xì)胞凋亡通路的影響。結(jié)果表明，PARP-1敲降能夠降低SM染毒后HaCaT細(xì)胞的凋亡，可能是通過降低內(nèi)源性和外源性凋亡途徑信號(hào)及凋亡蛋白的激活

26、來發(fā)揮作用。
　　3. PARP-1敲降對(duì)SM損傷后HaCaT細(xì)胞Akt/mTOR通路的影響
　　PARP-1可通過影響自噬抑制因子mTOR來參與自噬調(diào)節(jié)。為了研究SM染毒后是否對(duì) Akt/mTOR通路有影響以及 PARP-1如何參與到這個(gè)過程中，我們?cè)赑ARP-1敲降及對(duì)照的HaCaT細(xì)胞上檢測(cè)了Akt及mTOR的磷酸化。提示PARP-1下調(diào)可能通過Akt/mTOR通路的重新激活來抑制自噬。
　　上述結(jié)果提示PARP

27、-1敲降能顯著性的增加SM染毒后HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞活力，降低p-JNK、p-p53、Caspase9、Caspase8、c-PARP、Caspase3的激活和Annexin V的染色，進(jìn)一步證明了降低 PARP-1可以通過下調(diào)多個(gè)凋亡通路的檢查點(diǎn)來抑制SM造成的凋亡。另外，PARP-1敲降還能夠逆轉(zhuǎn)SM染毒導(dǎo)致的Akt/mTOR通路的抑制，從而可能通過Akt/mTOR的激活來抑制自噬。
　　通過以上研究，本論文主要得出以下結(jié)論：

28、
　　1. S003是一種強(qiáng)效的PARP-1抑制劑，其在體外對(duì)PARP-1的抑制活性是經(jīng)典的PARP-1抑制劑3-AB的180倍。
　　2. PARP-1抑制劑S003對(duì)SM染毒細(xì)胞模型和動(dòng)物模型均有明顯的保護(hù)作用。S003對(duì)高濃度SM染毒造成的HaCaT細(xì)胞活力降低有明顯的保護(hù)作用；S003對(duì)高濃度 SM造成的小鼠耳廓水腫及病理改變有明顯改善作用，對(duì)高濃度SM造成的無毛豚鼠皮膚紅腫和皮膚血流增加有明顯的降低作用。
　

29、　3. PARP-1抑制劑S003抗SM損傷的作用主要可能在于改善SM損傷造成的NAD+/ATP耗竭及降低凋亡和壞死。
　　4. PARP-1敲降可減輕SM損傷，而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)通路可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的重要途徑。
　　5. PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的DNA斷裂。
　　6.通過進(jìn)一步研究，S003有望發(fā)展為防治SM中毒的新型藥物。
　　總之，本研究首先經(jīng)過體內(nèi)外藥效學(xué)評(píng)價(jià)，篩選出了活性最好

30、的強(qiáng)效PARP-1抑制劑 S003，進(jìn)而采用 PARP-1抑制劑 S003給藥以及 PARP-1敲降的方法，對(duì)PARP-1抑制劑抗SM損傷的藥效及作用機(jī)理進(jìn)行了研究。結(jié)果提示，PARP-1抑制劑對(duì)高濃度SM小鼠耳廓染毒模型，無毛豚鼠皮膚染毒模型及HaCaT細(xì)胞模型均有明顯的保護(hù)作用。下調(diào)PARP-1抗SM損傷的作用機(jī)理主要為減輕SM損傷造成的NAD+/ATP耗竭，降低細(xì)胞凋亡壞死及自噬。然而，PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的D