高表達Sptlc2基因促油酸誘導的HSC-T6細胞凋亡及自噬.pdf

1、目的:本實驗擬從絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶長鏈亞基2（serine palmitoy ltransferase long chain base subunit2,Sptlc2）基因這一切入點，明確神經(jīng)酰胺從頭合成途徑關(guān)鍵酶Sptlc2對HSC-T6細胞凋亡及自噬的影響，證實干預HSC-T6細胞凋亡及自噬的新靶點。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)SD大鼠HSC-T6細胞株，進行分組：HSC-T6細胞組（正常對照組）、油酸誘導的HSC-T

2、6細胞組（油酸組）、油酸誘導的pcDNA3.1(+)-NC組（空載體組）、油酸誘導的pcDNA3.1(+)-Sptlc2組（Sptlc2轉(zhuǎn)染組），除正常對照組外，其余各組均采用100umol/l油酸共培養(yǎng)HSC-T6細胞。
　　2.轉(zhuǎn)染48小時后，應用qPCR技術(shù)檢測各組HSC-T6細胞內(nèi)Sptlc2 mRNA表達情況。
　　3.流式細胞儀檢測各組HSC-T6細胞凋亡情況。
　　4.MDC染色法熒光顯微鏡下觀察各組HS

3、C-T6細胞內(nèi)自噬體數(shù)量。
　　5.Western blot技術(shù)檢測各組HSC-T6細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2，自噬標志蛋白LC3B，自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1的蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.各組HSC-T6細胞內(nèi)Sptlc2 mRNA表達情況：油酸組與正常對照組比較，Sptlc2 mRNA表達明顯增加，差異具有顯著統(tǒng)計學意義P<0.01）。Sptlc2轉(zhuǎn)染組與油酸組、空載體組比較，Sptl

4、c2 mRNA表達明顯增加，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　2.各組HSC-T6細胞凋亡情況:油酸組與正常對照組比較，總凋亡率明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Sptlc2轉(zhuǎn)染組與油酸組、空載體組比較，總凋亡率明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　3.各組HSC-T6細胞內(nèi)自噬體數(shù)量：經(jīng)MDC染色后，應用熒光顯微鏡觀察顯示：油酸組與正常對照組比較，自噬體數(shù)量明顯增多。Sptlc

5、2轉(zhuǎn)染組與油酸組、空載體組比較，自噬體數(shù)量明顯增多。
　　4.各組HSC-T6細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表達情況：油酸組與正常對照組比較，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達明顯減少，Bax/Bcl-2比值明顯變大，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Sptlc2轉(zhuǎn)染組與油酸組、空載體組比較，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達明顯減少，Bax/Bcl-2比值明顯變大

6、，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；
　　5.各組HSC-T6細胞內(nèi)自噬標志蛋白LC3B，自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1的蛋白表達情況：油酸組與正常對照組比較，自噬標志蛋白LC3B-II表達明顯增加，自噬標志蛋白LC3B-I表達明顯減少，LC3B-II/LC3B-I比值明顯變大，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達明顯增加，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；自噬相關(guān)蛋白Atg

7、5表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Sptlc2轉(zhuǎn)染組與油酸組、空載體組比較，自噬標志蛋白LC3B-II表達明顯增加，自噬標志蛋白LC3B-I表達明顯減少，LC3B-II/LC3B-I比值明顯變大，差異具有顯著統(tǒng)計學意（P<0.01）；自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達明顯增加，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；自噬相關(guān)蛋白Atg5表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.油酸可以誘