維吾爾藥大苞荊芥對哮喘小鼠TGF-β-Smads通路的影響及Th17-Treg調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究哮喘患者Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞相關(guān)炎性因子的變化規(guī)律，探索哮喘肺內(nèi)炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。通過大苞荊芥對支氣管哮喘小鼠的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，探討維藥大苞荊芥對支氣管哮喘小鼠模型TGF-β/Smads信號通路介導(dǎo)Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)作用機(jī)制并評價并分析大苞荊芥對兩者的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：⑴采用多重蛋白定量技術(shù)（CBA法）檢測支氣管哮喘患者及正常人群血清中 Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的

2、蛋白表達(dá)變化；⑵將支氣管哮喘模型小鼠分為6組，分別為正常對照組、哮喘模型組、地塞米松治療組、大苞荊芥高劑量治療組、大苞荊芥中劑量治療組及大苞荊芥低劑量治療組。釆用卵清蛋白（OVA）聯(lián)合 Al（OH）3致敏法制備小鼠支氣管哮喘模型；觀察小鼠的行為學(xué)變化，采用肺組織切片HE染色觀察、氣道阻力測定、氣道肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果，測定氣道高反應(yīng)性；⑶流式細(xì)胞術(shù)檢測支氣管哮喘模型小鼠 Th17/Treg細(xì)胞特異性標(biāo)志物IL-17a+Th1

3、7、Foxp3+Treg及Th17/Treg比值的變化情況；⑷采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測支氣管哮喘小鼠Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、IL-17a、IL-23、RORγt轉(zhuǎn)錄水平變化情況，以及TGF-β/Smads信號通路中細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、Smad2/3、Smad7、TGF-β轉(zhuǎn)錄水平變化

4、情況；⑸酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測各組小鼠血清中Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、IL-17a、IL-6、TGF-β水平的變化情況，以及支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中IL-4水平的變化情況。Western-Blot法測定 pSmad2/3、pSmad7蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：①在支氣管哮喘患者血清中TGF-β（Treg）、IL-4（Th2）、IL-

5、6、IL-17a（Th17）的細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯高于正常人群，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在支氣管哮喘患者與正常人群血清中 IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)水平未見明顯差異（P＞0.05）；②通過對小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎性細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)：支氣管哮喘小鼠模型中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高，巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低；支氣管哮喘模型小鼠的細(xì)胞分類以嗜酸性粒細(xì)胞為主；通過測定各組間小鼠

6、氣道阻力的影響，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比各組間氣道阻力具明顯增加。哮喘模型組乙酰膽堿激發(fā)后可見，小鼠氣道阻力明顯增加，與其他各組相比差異明顯且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。四個治療組（地塞米松及大苞荊芥）經(jīng)乙酰膽堿激發(fā)后氣道阻力較正常組均增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但哮喘小鼠模型組相比較后我們可以發(fā)現(xiàn)，四個治療組（地塞米松及大苞荊芥）氣道阻力均明顯減小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組各組間地塞米松組與大苞荊芥各組相比氣道阻力增加不明顯

7、，大苞荊芥各治療組氣道阻力依大苞荊芥劑量遞減而逐漸增強(qiáng)。高劑量組氣道阻力較低，低劑量組氣道阻力較高。HE染色結(jié)果顯示，哮喘模型組小鼠支氣管及肺泡組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分結(jié)構(gòu)消失。支氣管粘膜可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管出現(xiàn)收縮的現(xiàn)象，管腔變窄，氣道上皮排列不整齊，甚至出現(xiàn)斷裂的情況。治療組較模型組的炎癥細(xì)胞浸潤情況明顯減輕；支氣管收縮較模型組好轉(zhuǎn)；管腔變窄情況模型組明顯改善，管腔直徑較模型組明顯變寬；③流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：地塞米松組及不

8、同劑量干預(yù)組Th17細(xì)胞百分比均明顯高于空白對照組（P＜0.01），同時均低于支氣管哮喘小鼠模型組（P＜0.01）。地塞米松組及不同劑量干預(yù)組Treg細(xì)胞百分比均明顯低于空白對照組（P＜0.01），同時均高于支氣管哮喘小鼠模型組（P＜0.01）。地塞米松組及不同劑量干預(yù)組Th17/Treg細(xì)胞比值均明顯高于空白對照組（P＜0.01），同時均低于支氣管哮喘小鼠模型組（P＜0.01）；④qRT-PCR結(jié)果顯示：TGF-β/Smad信號通路相

9、關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-17a、Smad2/3、Smad7、TGF-β的mRNA水平在支氣管哮喘模型小鼠中均有明顯改變。在各支氣管哮喘模型小鼠組中IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-βmRNA的表達(dá)均顯著高于對照組；地塞米松可以顯著降低模型組中 IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-β的mRNA表達(dá)情況，大苞荊芥也可以降低模型組中IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-β的mRNA表達(dá)。在各支

10、氣管哮喘模型小鼠組中Smad7的mRNA的表達(dá)均顯著低于對照組；地塞米松與大苞荊芥都可以顯著增加模型組中Smad7的mRNA表達(dá)；⑤ELISA結(jié)果顯示：炎性細(xì)胞相關(guān)因子IL-4、IL-10、IL-17a、IL-6、TGF-β在支氣管哮喘模型小鼠中均有明顯改變。大苞荊芥能夠降低支氣管哮喘小鼠模型 BALF中 IL-4的表達(dá)水平及外周血IL-17a、IL-6、pSmad2/3、TGF-β的表達(dá)水平，與此同時增加了外周血IL-10的表達(dá)水平。

11、Western-blot結(jié)果顯示：在支氣管哮喘模型小鼠組中pSmad2/3的表達(dá)均顯著高于對照組（P＜0.01），而pSmad7的表達(dá)明顯低于對照組；地塞米松可以顯著降低模型組中pSmad2/3的表達(dá)，也可以顯著增加模型組中pSmad7的表達(dá)，大苞荊芥也起到相似的作用。
　　結(jié)論：⑴支氣管哮喘患者外周血中存在CD4+T淋巴細(xì)胞免疫失衡，哮喘組患者血清中TGF-β、IL-4、IL-6、IL-17a的表達(dá)水平明顯高于正常人群，提示哮喘

12、組Th17細(xì)胞表達(dá)較正常組顯著增加，通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞比例，可能對干預(yù)支氣管哮喘進(jìn)程具有一定的作用；⑵通過OVA氣道致敏法，可成功建立支氣管哮喘小鼠模型；建立的支氣管哮喘模型小鼠的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎細(xì)胞分類以嗜酸性粒細(xì)胞為主；支氣管哮喘模型小鼠氣道阻力明顯增高；初步確認(rèn)大苞荊芥可以顯著改善支氣管哮喘模型小鼠的癥狀，改善支氣管肺泡的病理學(xué)變化；降低支氣管哮喘模型小鼠的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎性細(xì)胞數(shù)量；降

13、低支氣管哮喘模型小鼠的氣道高反應(yīng)性；⑶地塞米松和大苞荊芥能夠使 Th17細(xì)胞數(shù)量減少同時使得 Treg細(xì)胞增加。大苞荊芥和地塞米松均可以顯著的恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞分化的平衡的能力。提示大苞荊芥可能通過某種方式參與Th17/Treg細(xì)胞分化及相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)；⑷研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號是初始T細(xì)胞分化成Th17與Treg細(xì)胞時必不可少的信號分子之一，TGF-β與IL-6的協(xié)同作用在Th17細(xì)胞分化中起到十分重要的作用，Smad2/3

14、與Smad7的磷酸化也是影響 Th17細(xì)胞分化的重要調(diào)控因素之一；⑸本研究通過建立并觀察小鼠支氣管哮喘模型，發(fā)現(xiàn)在支氣管哮喘發(fā)生時，炎癥反應(yīng)隨之發(fā)生，TGF-β/Smad通路上的關(guān)鍵細(xì)胞因子TFG-β與Smad2/3、IL-6的表達(dá)皆有升高，TGF-β/Smad通路被激活，與此同時Th17/Treg細(xì)胞比值表現(xiàn)出明顯上升；⑹而在地塞米松及大苞荊芥的作用下，該通路中TGF-β，IL-6與磷酸化的Smad2/3皆隨之下降，而磷酸化的Smad

15、7則開始上調(diào)，而此時也伴隨著Th17/Treg細(xì)胞比值明顯下降。由此我們推測TGF-β/Smad在支氣管哮喘的發(fā)生過程中起到促炎的作用；⑺而大苞荊芥可能通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)TGF-β/Smad通路下游關(guān)鍵信號分子Smad2/3及Smad7的磷酸化進(jìn)而影響TGF-β與IL-6的表達(dá)，進(jìn)一步影響調(diào)節(jié)Th17與Treg的分化，從而對小鼠支氣管哮喘的炎癥產(chǎn)生抑制作用，而對于探明大苞荊芥的有效作用靶點(diǎn)和更深一步的影響作用機(jī)制而言還需要在以后的研究工作