柴樸湯對肝郁型哮喘Th17-Treg失衡及嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　1、探討肝郁證對哮喘Thl7/Treg失衡及嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）凋亡的影響；
　　2、研究柴樸湯對肝郁型哮喘Thl7/Treg失衡的影響；
　　3、研究柴樸湯對肝郁型哮喘EOS凋亡及相關(guān)凋亡基因p53和bcl-2表達(dá)的影響。
　　方法:
　　本研究分為兩個(gè)部分：
　　1、肝郁型哮喘大鼠模型的建立和評價(jià)：40只雄性清潔級SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、哮喘組、肝郁組和肝郁哮喘組。第一階段

2、：肝郁組和肝郁哮喘組于第1~28天予以28天慢性不可預(yù)見性應(yīng)激的刺激（CUMS）；對照組和哮喘組不作特殊處理。第二階段：哮喘組和肝郁哮喘組大鼠于實(shí)驗(yàn)第29天腹腔注射1ml抗原液（含10mg OVA、100mg氫氧化鋁凝膠）初次致敏，實(shí)驗(yàn)第36天重復(fù)一次以加強(qiáng)致敏，對照組和肝郁組予以等量生理鹽水代替。從第43天開始，將哮喘組和肝郁哮喘組大鼠置于霧化箱中，每天霧化吸入1％ OVA20 min，對照組和肝郁組以生理鹽水代替霧化。采用Buxco

3、動(dòng)物呼吸功能測定系統(tǒng)，測量各組大鼠氣道阻力；建模前后分別予以體征變化、蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)、開野活動(dòng)度、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行肝郁證模型評價(jià)；流式細(xì)胞技術(shù)檢測肺泡灌洗液（BALF）中EOS的凋亡及外周血中T細(xì)胞亞群（Thl7/Treg）的比例；通過肺組織石蠟切片蘇木素-伊紅（HE）染色觀察各組氣道病理改變；用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測BALF中IL-17、IL-10含量。
　　2、柴樸湯對肝郁型哮喘Thl7/Treg失衡、EOS凋亡及凋亡基因p

4、53和bcl-2表達(dá)的影響：40只雄性清潔級SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、肝郁哮喘組、地塞米松組和柴樸湯組。按前述方法造模，在第二階段每次超聲霧化前30min，各組大鼠經(jīng)灌胃給藥，地塞米松組給予地塞米松0.001 g/Kg，柴樸湯組給予柴樸湯3.20g/Kg，對照組和肝郁哮喘組予以等量生理鹽水10 ml/Kg。建模前后分別予以體征變化、蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)、開野活動(dòng)度、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等指標(biāo)進(jìn)行肝郁證模型評價(jià)；采用Buxco動(dòng)物呼吸功能測定系

5、統(tǒng)，測量各組大鼠氣道阻力；流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血中T細(xì)胞亞群（Thl7/Treg）的比例和肺泡灌洗液（BALF）中EOS的凋亡情況；用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測BALF中IL-17、IL-10含量。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定法檢測肺組織p53 mRNA、bcl-2 mRNA的表達(dá)；用免疫印跡(Western blot)法檢測肺組織中p53和bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、肝郁型哮喘模型建立的評價(jià)：肝郁

6、哮喘組的體質(zhì)量增長顯著低于對照組，糖水消耗量、開野活動(dòng)度試驗(yàn)水平活動(dòng)得分、垂直活動(dòng)得分均低于對照組，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間長于對照組，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。哮喘組、肝郁哮喘組均表現(xiàn)出呼吸頻率加快、節(jié)律不齊、出現(xiàn)點(diǎn)頭呼吸，口周發(fā)紺，煩躁不安，其毛發(fā)無光澤、豎立，表明哮喘激發(fā)成功，肺功能測定哮喘組和肝郁哮喘組氣道阻力均高于對照組（P<0.01）。肺組織 HE染色顯示哮喘組：氣道及周圍組織可見嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞水

7、腫、脫落；支氣管黏膜及平滑肌增生，部分可見平滑肌破壞斷裂，管腔內(nèi)有分泌物。肝郁哮喘組：支氣管小氣道黏膜及平滑肌增生嚴(yán)重；可見平滑肌破壞斷裂，部分小氣道閉塞，炎性細(xì)胞浸潤明顯，肺泡內(nèi)可見滲出物并呈擴(kuò)張態(tài)。
　　肝郁哮喘組和哮喘組炎性細(xì)胞總數(shù)（（96.86±4.43）×107/L、（88.22±3.22）×107/L）、嗜酸性粒細(xì)胞比例（（27.58±4.65）%、（22.67±2.43）%）、Th17細(xì)胞比例（（7.24±1.01）

8、%、（6.11±0.78）%）和IL-17水平（（48.88±8.06）pg/mL）、（42.14±6.32）pg/mL）均高于對照組（（30.58±2.49）×107/L、（0.78±0.12）%、（2.80±0.41）%、（24.11±3.40）pg/mL）（P<0.01）；肝郁哮喘組和哮喘組 Treg細(xì)胞比例（（3.09±0.55）%、（3.96±0.66）%）及IL-10水平（（19.79±2.80）pg/mL、（20.29±3

9、.12） pg/mL）均低于對照組（（8.18±1.26）%、（30.79±5.22）pg/mL）（P<0.01）。肝郁哮喘組炎性細(xì)胞總數(shù)（96.86±4.43）×107/L、嗜酸性粒細(xì)胞比例（27.58±4.65）%及Th17細(xì)胞比例（7.24±1.01）%和IL-17水平（48.88±8.06） pg/mL均高于哮喘組（（88.22±3.22）×107/L、（22.67±2.43）%、（6.11±0.78）%、（42.14±6.32

10、）pg/mL（P<0.05）；肝郁哮喘組Treg細(xì)胞比例（3.09±0.55）%低于哮喘組（3.96±0.66）%（P<0.05）。
　　2、柴樸湯組大鼠體質(zhì)量增長顯著高于肝郁哮喘組，糖水消耗量、開野活動(dòng)度試驗(yàn)水平活動(dòng)得分、垂直活動(dòng)得分均高于肝郁哮喘組，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間低于肝郁哮喘組，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與地塞米松組比較，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。柴樸湯組 Th17細(xì)胞比例（3.81±0.79）

11、%低于肝郁哮喘組（7.79±1.61）%（P<0.01），且低于地塞米松組（4.76±0.84）%（P<0.05）；柴樸湯組Treg細(xì)胞比例（5.99±0.94）%高于肝郁哮喘組（2.92±0.48）%（P<0.01），且高于地塞米松組（5.02±0.80）%（P<0.05）。柴樸湯組和地塞米松組IL-17水平（34.88±7.06）pg/mL、（39.11±8.12）pg/mL均低于肝郁哮喘組（51.24±10.32） pg/mL；柴

12、樸湯組和地塞米松組IL-10水平（35.79±8.80）pg/mL、（31.12±7.90） pg/mL均高于肝郁哮喘組（21.29±5.12）pg/mL。柴樸湯組Th17/Treg比例（0.64±0.36）低于肝郁哮喘組（2.53±0.68）（P<0.01），且低于地塞米松組（0.95±0.52）（P<0.05）。柴樸湯組BALF中EOS比例（6.58±3.65）%低于肝郁哮喘組（23.68±2.47）%（P<0.01）。柴樸湯組和地

13、塞米松組EOS凋亡比例（15.60±2.01）%、（17.29±2.16）%均高于肝郁哮喘組（2.11±1.12）%（P<0.01）。
　　肝郁哮喘組肺組織中p53 mRNA的表達(dá)較對照組明顯減弱（P<0.01），柴樸湯組和地塞米松組p53 mRNA的表達(dá)則較肝郁哮喘組增強(qiáng)（P<0.05）。肝郁哮喘組肺組織中bcl-2 mRNA的表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)（P<0.01），柴樸湯組和地塞米松組bcl-2 mRNA的表達(dá)則較肝郁哮喘組減弱

14、（P<0.05）。Western blot顯示肝郁哮喘組p53蛋白的表達(dá)較對照組明顯減弱（P<0.01），bcl-2蛋白的表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)（P<0.01），柴樸湯組和地塞米松組p53蛋白的表達(dá)較肝郁哮喘組增強(qiáng)（P<0.05），柴樸湯組和地塞米松組 bcl-2蛋白的表達(dá)則較肝郁哮喘組減弱（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、Th17/Treg失衡在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，肝郁證可通過增加Th17/Treg比例失衡