Th17-Treg失衡及其與中性粒細胞相互影響在ARDS發(fā)病中的作用和機制研究.pdf

1、目的:
　　急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種導(dǎo)致危重癥患者高病死率和致殘率的急性呼吸衰竭。雖經(jīng)大量基礎(chǔ)和臨床研究，ARDS的發(fā)病機制仍不明了，但無疑免疫炎癥細胞及其相關(guān)炎性介質(zhì)影響著ARDS的進展及其預(yù)后。中性粒細胞(PMN)在肺部積聚、凋亡延遲以及凋亡后未被及時清除而引起的瀑式炎癥反應(yīng)，被認為是引發(fā)ARDS的重要機制。但近年來，淋巴細胞，特別是CD4+T細胞在ARDS發(fā)病中的作用尤為引人關(guān)注。新近發(fā)現(xiàn)的促炎性CD4+T細胞亞

2、群，Th17細胞和抑炎性的Treg細胞間的平衡在眾多免疫炎癥性疾患中發(fā)揮著重要作用。而活化的PMN分泌大量炎癥因子，是調(diào)節(jié)Th17、Treg細胞分化的潛在新來源，反過來Th17、Treg細胞又可以影響PMN在炎癥部位的積聚、凋亡及其功能改變。本研究首先觀測Th17、Treg細胞及其相關(guān)因子的變化，探討Th17/Treg失衡與ARDS患者肺損傷程度及臨床結(jié)局的關(guān)聯(lián)，明確Th17/Treg失衡在ARDS發(fā)病中的臨床意義;然后通過體外細胞實驗

3、觀察PMN對Th17/Treg平衡的影響，以及Th17、Treg細胞對PMN趨化、凋亡等功能的改變，探討PMN和Th17/Treg平衡相互影響在ARDS發(fā)病中的作用，從而闡述全身炎癥反應(yīng)引發(fā)ARDS時，固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)相互調(diào)控在ARDS發(fā)病中的作用，為揭示ARDS的免疫學(xué)發(fā)病機制并在此環(huán)節(jié)上進行干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.以79例ARDS患者和26名健康志愿者為研究對象，采用流式細胞儀(FCM)、酶聯(lián)

4、免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測外周血Th17、Treg細胞及其相關(guān)細胞因子（IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1）的表達。收集研究對象人口統(tǒng)計學(xué)和臨床基線資料，同時記錄急性生理和慢性健康(APACHE)Ⅱ評分、序貫器官衰竭(SOFA)評分和肺損傷評分。主要結(jié)局定義為隨訪28天時ICU或者院內(nèi)病死率。
　　2.免疫磁珠法分離、純化PMN、初始CD4+T細胞、Th17和Treg細胞，并通過FCM及臺盼蘭染色后鏡檢上述細胞

5、的純度和活力。采用接觸共培養(yǎng)和Transwell體系培養(yǎng)，研究PMN對初始CD4+T細胞極化方向的影響及其機制。FCM檢測Th17、Treg細胞的表達，RT-PCR檢測Th17、Treg細胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3的表達，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1的含量， FCM和Western Blot檢測PMN細胞表達MHCⅡ類分子。采用Transwell小室培養(yǎng)研究PMN對Th17細胞的趨化作

6、用和相關(guān)機制。FCM檢測Th17細胞CCR2、CCR6受體的表達，ELISA法檢測ARDS患者、正常對照組外周血中以及PMN細胞內(nèi)CCL2和CCL20的含量，觀察預(yù)先加或不加抗CCL2和CCL20的中和性單抗，PMN對Th17細胞趨化的影響。
　　3.應(yīng)用接觸共培養(yǎng)和Transwell體系培養(yǎng)，探討Th17、Treg細胞對PMN趨化、活性以及凋亡的影響和機制。ELISA法檢測Th17、Treg細胞內(nèi)IL-8、GM-CSF和IFN-

7、γ的含量，F(xiàn)CM檢測PMN細胞表面CD11b的表達及其凋亡。在部分實驗中，預(yù)先加或不加抗IL-8、GM-CSF和IFN-γ的中和性單抗，觀察Th17細胞對PMN的趨化、活性和凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.ARDS患者外周血Th17、Treg細胞頻數(shù)以及Th17/Treg比值均較正常對照組明顯升高，隨ARDS患者肺損傷程度加重，Th17/Treg比值亦在輕、中、重度ARDS患者組中遞增。與正常對照組相比，Th17細胞相關(guān)性

8、細胞因子，IL-6和IL-17水平均明顯升高，而Treg細胞相關(guān)的細胞因子，IL-10水平雖高于正常對照組，但TGF-β1水平在各組間無差異。Th17/Treg比值與APACHEⅡ評分、SOFA評分以及肺損傷評分均呈顯著正相關(guān)，而與氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)負相關(guān)。受試者工作特征曲線(ROC)分析發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg比值預(yù)測ARDS患者28d病死率的ROC曲線下面積高于APACHEⅡ評分、SOFA評分、急性肺損傷評分和PaO2/

9、FiO2。以＞0.79為截斷值，Th17/Treg比值預(yù)測28d病死率的敏感性、特異性、陽性似然比和陰性似然比分別為87.5％、68.1％、2.74和0.18。Logistic回歸分析表明Th17/Treg比值是預(yù)測ARDS患者28d病死率的獨立變量(OR=8.68，p=0.002)。此外，Kaplan-Meier生存分析表明Th17/Treg比值＞0.79的ARDS患者有較高的28d病死率(Log-rank test，p＜0.001)

10、。
　　2.PMN和初始CD4+T細胞直接接觸共培養(yǎng)后，ARDS患者外周血PMN膜表面能顯著高表達MHCⅡ類分子，且培養(yǎng)體系中Th17細胞及其特異性轉(zhuǎn)錄因子（RORγt）和相關(guān)細胞因子(IL-17、IL-6)的表達均明顯增加。而上述共培養(yǎng)結(jié)果，能被培養(yǎng)體系中預(yù)先加入抗MHCⅡ類分子的中和性抗體所拮抗。同時，未觀察到PMN對Treg細胞分化有影響。另外，ARDS患者外周血Th17細胞高表達CCR2、CCR6受體，其外周血和PMN細胞

11、內(nèi)CCL2和CCL20的含量亦較正常組高。與抗CCL2或/和CCL20的中和性單抗預(yù)培養(yǎng)后，PMN趨化Th17細胞的能力明顯受限。
　　3.ARDS患者外周血Th17細胞能較正常對照組顯著高表達IL-8、GM-CSF和IFN-γ。與抗IL-8中和性單抗預(yù)培養(yǎng)后，Th17細胞趨化PMN的效應(yīng)被完全阻斷。無論是直接接觸共培養(yǎng)還是Transwell體系培養(yǎng)，Th17細胞都能上調(diào)PMN表達膜蛋白CD11b，以及減少PMN凋亡，而上述效應(yīng)能

12、被抗GM-CSF和IFN-γ的中和性單抗預(yù)先與Th17細胞孵育后所拮抗。另外，Treg細胞對PMN無趨化作用。Treg細胞通過直接接觸共培養(yǎng)，而非Transwell體系培養(yǎng)，才能下調(diào)PMN表達CD11b，并促進其凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.ARDS患者外周血中早期即有Th17、Treg細胞及其相關(guān)細胞因子的變化，Th17/Treg比值與ARDS發(fā)病有關(guān)，并且較高的Th17/Treg比值是與更差的臨床預(yù)后相關(guān)聯(lián)。此外，重塑患者

13、體內(nèi)Th17/Treg平衡可能是個治療包括ARDS在內(nèi)的各種免疫炎癥性疾病的新的、有效策略。
　　2.PMN需與初始CD4+T細胞直接接觸并依賴MHCⅡ類分子途徑，才能促進后者分化為Th17細胞。PMN還能釋放CCL2和CCL20趨化Th17細胞浸潤入肺，導(dǎo)致Th17/Treg平衡向促炎性Th17細胞優(yōu)勢轉(zhuǎn)化。
　　3.Th17細胞既能釋放IL-8趨化PMN，又可通過GM-CSF和IFN-γ增強PMN的活性和抑制其凋亡，使得