茯芪顆粒對肝纖維化低蛋白血癥的藥效學(xué)及機(jī)制研究.pdf

1、目的：在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，茯芪顆粒是根據(jù)解放軍302醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方---“茯白方”通過處方優(yōu)化、工藝及制劑篩選而成。處方由黃芪、茯苓、當(dāng)歸、楮實(shí)子、阿膠及發(fā)酵蟲草菌粉藥味組成，臨床研究初步確定該顆粒制劑具有一定的抗肝纖維化低蛋白血癥的作用效果。本研究旨在通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，考察茯芪顆粒治療肝纖維化低蛋白血癥的作用和探討作用的分子機(jī)制，期望尋找茯芪顆?？垢卫w維化低蛋白血癥的作用靶點(diǎn)，為茯芪顆粒臨床治療肝纖維化提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和合理的治療理論。

2、
　　方法：
　　①茯芪顆粒制備工藝研究：采用現(xiàn)代制劑工藝技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)湯劑用藥習(xí)慣，選擇適合的提取、濃縮及干燥條件，并考察顆粒劑的制備工藝，制備出可供質(zhì)量控制檢驗(yàn)及用于藥效學(xué)研究的茯芪顆粒制劑。
　?、谲蜍晤w粒的質(zhì)量控制：采用薄層色譜及高效液相色譜法，鑒別茯芪顆粒中主要藥物的有效成分及含量，確保茯芪顆粒質(zhì)量穩(wěn)定。
　?、圮蜍晤w粒的藥效學(xué)及機(jī)制研究：通過建立CCl4致小鼠、大鼠肝纖維化低蛋白血癥模型和TAA誘導(dǎo)大

3、鼠肝纖維化低蛋白血癥模型，采用卡介苗聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型，考察茯芪顆粒對肝纖維化低蛋白血癥的影響；同時(shí)，采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)低下模型，考察茯芪顆粒對小鼠免疫功能的影響。
　　結(jié)果：
　?、僖灾嗅t(yī)藥理論為指導(dǎo)，確定茯芪顆粒制劑處方，以黃芪、茯苓、當(dāng)歸、楮實(shí)子混合加8倍量水進(jìn)行煎煮2次，第一次煎煮時(shí)間為1.5小時(shí)，第二次煎煮時(shí)間為1小時(shí)，合并煎煮液并濃縮，將所得浸膏進(jìn)行干燥，打粉。再與過篩的阿膠粉

4、及發(fā)酵蟲草菌粉混勻，加糊精制粒。
　?、谕ㄟ^茯芪顆粒的薄層色譜分析，結(jié)果顯示薄層板相同位置上存在與當(dāng)歸及楮實(shí)子對照藥材相一致的斑點(diǎn)；高效液相色譜分析以黃芪甲苷為主要考察指標(biāo)，進(jìn)行含量測定及方法學(xué)考察，結(jié)果精密度、重復(fù)性及加樣回收試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3％；樣品專屬性結(jié)果顯示，黃芪甲苷峰與其它組分色譜峰可達(dá)到基線的分離，而陰性對照溶液中的色譜峰對其測定無影響。
　?、鄹喂δ軝z測：從生化指標(biāo)分析，茯芪顆?？山档虲Cl

5、4致小鼠、大鼠肝纖維化及TAA誘導(dǎo)大鼠肝纖維化引起的血清ALT、AST、ALP水平的升高，抑制ALB、TP水平的降低，具有顯著性差異（P<0.05）。各給藥組可不同程度地降低不同因素誘導(dǎo)肝纖維化模型動(dòng)物血清中PC-III、IV C、LN、HA水平，差異有顯著意義（P<0.05）。對BCG+LPS誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP含量的升高，ALB、TP水平的降低亦有較強(qiáng)的抑制作用，存在顯著差異（P<0.05）。同時(shí)，茯芪顆粒

6、可提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。肝組織病理學(xué)檢查，不同化學(xué)因素誘導(dǎo)模型組動(dòng)物肝組織均出現(xiàn)纖維組織增生，且有肝小葉形成。給予茯芪顆粒不同劑量后，肝組織病理顯示肝纖維化程度顯著改善。
　?、茏饔脵C(jī)制初步研究：α-SMA免疫組化測試結(jié)果表明陽性片細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色，陰性片無著色；蛋白印跡結(jié)果顯示肝纖維化模型組p-mTOR及HIF-1α的蛋白表達(dá)降低，且差異明顯（P<0.05），給予茯芪顆粒后，p-mTOR及HIF-1α表

7、達(dá)的含量較模型組升高，具有顯著性差異（P<0.05）；TIMP-1與MMP-9的RT-PCR分析表明CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型組大鼠肝組織內(nèi)TIMP-1的表達(dá)增強(qiáng)，而MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，呈顯著性差異（P<0.05）。相反，茯芪顆粒組大鼠肝組織內(nèi)TIMP-1的表達(dá)呈現(xiàn)顯著降低，而MMP-9蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異顯著（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　?、偻ㄟ^臨床應(yīng)用，選擇茯芪顆粒制劑處方藥材，確定黃芪、茯苓、當(dāng)歸、楮實(shí)子的