甘苦口服液的研制及其抗肝纖維化藥效學的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 各種肝病所致的肝纖維化嚴重危害人類健康，給家庭、社會帶來沉重的負擔，研究開發(fā)治療肝纖維化的藥物、特別是中藥具有重要的社會、經(jīng)濟意義。將中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代藥理學研究成果結(jié)合起來，結(jié)合古今臨床實踐，篩選出能治療肝纖維化的中藥，提取活性成分將之組合成方，然后進行實驗研究及臨床試驗的方法，是研究開發(fā)中藥新藥的一種行之有效的手段。因此，在這種思想的指導下，筆者考察了大量的中醫(yī)古代文獻、現(xiàn)代研究文獻及國內(nèi)外現(xiàn)代藥理學研

2、究成果，篩選出甘草、苦參兩味中藥。甘草補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥。用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性，有效成分為甘草甜素;苦參清熱燥濕，殺蟲，利尿，用于熱痢，便血，黃疸，尿閉，有效成分為苦參堿?，F(xiàn)代藥理研究表明二者皆有保肝、抗炎，抗病毒等治療肝纖維化的作用。臨床資料顯示，甘草甜素聯(lián)合苦參堿靜脈滴注對于慢性乙型肝炎治療效果良好。但是慢性疾病需要長期服用藥物，靜

3、脈滴注，患者順應性差。因此筆者選擇研究甘草甜素和苦參堿聯(lián)合口服給藥治療肝纖維化，將二者有效活性成分組合成方，命名為甘苦口服液。為了研究甘苦口服液抗肝纖維化的作用效果，本課題首先對兩者的配伍進行篩選，選擇出最佳配比，制備成口服液。進行HPLC測定甘苦口服液中甘草酸銨和苦參堿的含量進行方法學考察，確定檢測條件;對甘苦口服液的穩(wěn)定性進行考察，觀察其各種環(huán)境下外觀、PH值、相對密度和含量的改變;采用急毒試驗考察甘苦口服液的安全性。最后，對甘苦口

4、服液進行抗肝纖維化的藥理效應及作用機理進行研究，為以后的臨床試驗奠定實驗基礎。
　　 方法:
　　 1.采用四氯化碳(CCl4)、硫代乙酰胺(TAA)和異體豬血清三種方式，對SD大鼠腹腔注射給藥，模擬肝纖維化模型。并對這三種動物模型的血清ALT，AST，HA和肝勻漿SOD和MDA檢測，取肝組織進行HE染色，分別觀察肝組織的損傷程度和膠原增生的情況等進行比較。
　　 2.運用TAA誘導大鼠肝纖維化模型，采用均勻設計

5、法（二因素五水平）分組實驗，并設有正常組，模型組，以大鼠肝組織Hyp含量作為檢測指標，經(jīng)均勻設計軟件3.0處理分析得最佳處方;運用相同方法誘導大鼠肝纖維化模型，設正常組，模型組，秋水仙堿組，最佳處方組，通過觀察肝組織羥脯氨酸含量，大鼠血清HA，ALT，AST，ALB含量以及肝組織纖維化變化，對于最佳處方的療效進行比較和驗證實驗。找到最佳處方后，按照最佳處方制備成甘苦口服液。
　　 3.建立HPLC法測定甘苦口服液的含量，進行方法

6、學考察。穩(wěn)定性實驗法，按各法分別檢測樣品的澄明度，PH值，相對密度等，并采用HPLC法測定復方中甘草甜素和苦參堿含量。
　　 4.以預實驗結(jié)果，在最大劑量840mg/kg，最小劑量141.3mg/kg之間，設置6組，每組10只小鼠，一次性灌胃后觀察14天，記錄實驗結(jié)果。解剖觀察死亡小鼠的心、肝、腎和腦等主要器官，做病理切片HE染色觀察。采用Bliss統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，采用Probit回歸計算甘苦口服液對小鼠的LD50。

7、r>　　 5.大鼠設正常組，模型組，以苦參堿計，甘苦口服液高(140mg/kg)，中(70mg/kg)，低(35mg/kg)劑量組，中劑量(70mg/kg)預防組，陽性對照美能(70mg/kg)組。除正常組外，其他按模型制備方法腹腔注射TAA，中劑量預防組同時給予合劑，四周后模型組與正常組生理鹽水灌胃，其他五組分別給藥。第八周末次給藥后，禁食，第二天麻醉大鼠，腹主動脈采血，取血清，并取肝臟，做以下檢測項:
　　 1)肝功能血清

8、生化指標ALT、AST、ALB、G。
　　 2)肝纖維化指標:HA、LN、PC-Ⅲ。
　　 3)細胞因子:TNF-α、TGF-β1、IL-13。
　　 4)新鮮肝組織勻漿MDA、SOD、Hyp。
　　 5)HE染色，Masson膠原染色。
　　 6)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白、α-SMA、TIMP-1免疫組織化學染色。
　　 統(tǒng)計學處理:
　　 計量資料以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。缺

9、失值的處理:剔除分析所涉及變量中帶缺失值的觀察單位。用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。對隨機設計的多樣本資料進行單因素方差分析(One-wayANOVA)多重比較方法，選擇LSD和SNK法;方差不齊時選擇近似F檢驗Welch法，多重比較方法選擇Dunnett'sT3法。P＜0.05認為有統(tǒng)計（學）差異。比較各組的增重差異采用協(xié)方差分析。等級資料采用多組秩和檢驗（Kruskal-WallisHtest），P＜0.05認為有統(tǒng)計（學）差異

10、。均勻設計采用均勻設計軟件3.0處理數(shù)據(jù)，對各組Hyp含量進行回歸分析，獲得回歸方程，得出理論上的最佳處方。急毒試驗采用Bliss統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，Probit回歸計算甘苦口服液對小鼠LD50。
　　 結(jié)果:
　　 1.空白組在造模期間無大鼠死亡，CCL4組在第4，8周各死亡1只。TAA組在第7周時死亡1只，豬血清組在第2周時死亡1只。CCL4組、TAA組、豬血清組與空白組相比增重有顯著差異(P均為0.000)，豬

11、血清組與CCL4組、TAA組相比增重有顯著差異(P均為0.000)。ALT值CCL4組、TAA組與空白組相比有顯著差異(P=0.001，P=0.000)。AST值各組與空白組相比有顯著差異(P均為0.000)。HA值各組與空白組相比均有顯著差異(P均為0.000)，各組組間比較，也有顯著差異(P＜0.01)。MDA值CCL4組、TAA組與空白組相比有顯著差異(P均為0.000)。SOD值CCL4組、TAA組與空白組相比有顯著差異(P=0

12、.015，P=0.000)。各組病理學觀察空白組肝細胞正常無病變。CCl4組、TAA組、豬血清組肝細胞病變明顯，程度依次為CCl4組＞TAA組＞豬血清組。CCl4組的SSS計分高于TAA組(P＝0.000)，而TAA組的SSS計分高于豬血清組(P＝0.001)。
　　 2.處方篩選結(jié)果顯示，經(jīng)均勻設計3.0軟件逐步回歸分析，得回歸方程:Y=456-0.575X1-0.02X12×X2，復相關系數(shù)R=0.9986，決定系數(shù)R2=0

13、.9971，最佳配比為苦參堿和甘草甜素均為70mg/kg。驗證實驗結(jié)果，HE染色鏡下觀察模型組肝細胞病變明顯，大量假小葉形成;秋水仙堿組與優(yōu)化處方組肝細胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，匯管區(qū)有少量顯微組織增生，也有不同程度的變性，壞死，但較模型組有明顯改善，二者相比無明顯差異。Hyp、HA含量給藥組顯著低于模型組(P＜0.01)。ALB，ALT，AST值給藥組與模型組比較有差異(P＜0.05）。根據(jù)均勻設計與藥效學再驗證結(jié)果制備甘苦口服

14、液為淡黃色澄清液體，味甜，微澀。25℃時PH值為7.2，相對密度1.005。
　　 3.建立了HPLC法測定甘苦口服液中的甘草甜素和苦參堿含量。甘草甜素色譜條件:色譜柱:DIKMA，Diamonsil5uC18色譜柱(250×4.6mm)，柱溫30℃，流動相:乙腈∶0.05％磷酸水溶液=45∶55(PH=3)流速:1ml/min，紫外檢測波長254nm。苦參堿色譜條件:色譜柱:DIKMA，Diamonsil5uC18色譜柱(25

15、0×4.6mm)，柱溫30℃，流動相:乙腈:0.1％磷酸水溶液(三乙胺調(diào)PH至8)=35∶65，流速:1ml/min，紫外檢測波長220nm。方法的專屬性，線性關系，準確度，精密度，穩(wěn)定性均良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果，在強光照射，高溫條件下其有關物質(zhì)有變化，PH值和相對密度均有改變，含量也降低，但外觀無變化。低溫條件下有結(jié)晶析出，恢復正常溫度又可重新變澄清。其他性狀和內(nèi)在質(zhì)量等各項指標均無明顯變化。
　　 4.根據(jù)Bliss法計算，得

16、到回歸方程y(Probit)=-5.3694+4.2167Log(D)。半數(shù)致死量LD50=287.84mg/kg，LD50(Feiller校正)95％的可信限=224.08～360.08mg/kg，LD5=117.23mg/kg，LD95=706.72mg/kg。大體解剖觀察結(jié)果顯示肝臟有淡黃色隨濃度加大而加深，其他心、肝、和腎臟與對照組相比，均無明顯變化。HE染色結(jié)果，心臟心肌間質(zhì)血管充（淤）血，心肌細胞輕度萎縮、變性，心肌細胞間可

17、見脂肪侵潤。腦組織神經(jīng)元紊亂，有神經(jīng)細胞退變現(xiàn)象。少數(shù)神經(jīng)細胞出現(xiàn)固縮，提示神經(jīng)系統(tǒng)有退行性變。
　　 5.甘苦口服液抗肝纖維化藥效學研究結(jié)果:ALT、AST、G、MDA、Hyp值甘苦口服液各組、美能組與模型組比較均有差異(P＜0.01或P＜0.05)，ALB、HA、TGF-β1值除低劑量組(35mg/kg)外與模型組比較均有差異(P＜0.01或P＜0.05)。LN值、PC-Ⅲ值甘苦口服液各組、美能組與模型組比較有差異(P＜0.

18、01或P＜0.05)。TNF-α、IL-13、SOD值除高劑量組(140mg/kg)外與模型組比較均有差異(P＜0.01或P＜0.05)。HE染色、Masson染色結(jié)果低劑量組(35mg/kg)同模型組相比，未見明顯差異，高劑量組(140mg/kg)同模型組相比，肝細胞壞死程度有所減輕。中劑量組(70mg/kg)、中劑量預防組(70mg/kg)、美能組同模型組相比，肝細胞壞死程度明顯減輕，三組差異不算明顯。SSS評分中劑量組(70mg/

19、kg)、中劑量預防組(70mg/kg)、美能組與模型組比較有差異(P＜0.01或P＜0.05)。肝纖維化分期比較，甘苦口服液各劑量組與模型組有差異(P＜0.05)。Ⅰ型、Ⅲ型膠原陽性細胞免疫組化染色弱于模型組（P＜0.01），α-SMA、TIMP-1的表達明顯降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CCl4、TAA、豬血清三種方法均可誘導肝纖維化模型。豬血清誘導的免疫性肝纖維化的特征為膠原纖維間隔纖細，缺乏明顯的

20、炎癥反應和顯著的肝細胞損傷，效果差于其他兩個實驗組。CCl4組大鼠在誘導期間一般情況差，且并發(fā)癥較其他組大鼠多。TAA成功地誘導出肝纖維化模型，其腹腔注射更易于控制大鼠的攝入量，組內(nèi)差異小，組間差異較易于量化控制，重復性較好。利用TAA腹腔注射制備肝纖維化模型，是比較理想的實驗肝纖維化模型制備方法，值得筆者在接下來的實驗中采用。
　　 2.均勻設計軟件處理得到最佳配比為苦參堿和甘草甜素均為70mg/kg。藥效學再驗證，病理學觀察

21、顯示均勻設計法篩選出的最佳處方能明顯改善TAA造模大鼠肝纖維化的程度，修復受損的肝細胞，能顯著降低TAA造模大鼠的HA，Hyp含量，能顯著改變TAA造模大鼠的血清ALB，ALT，AST值。
　　 3.本實驗采用的HPLC法測定甘草酸銨和苦參堿的方法適合甘苦口服液中甘草酸銨和苦參堿的含量測定以及藥物代謝實驗血藥濃度的測定。回收率實驗的結(jié)果表明本方法準確性較好，精密度實驗和穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明本方法穩(wěn)定性較好，符合定量測定要求。穩(wěn)定性

22、實驗結(jié)果表明3批樣品在一年內(nèi)性狀穩(wěn)定，pH值及相對密度都在合格范圍內(nèi)，樣品中甘草甜素和苦參堿含量在一年內(nèi)均比較穩(wěn)定，因此可認為甘苦口服液劑的質(zhì)量在一年內(nèi)是穩(wěn)定可靠的。
　　 4.解剖觀察結(jié)果顯示肝臟有淡黃色隨濃度加大而加深，可能是由于肝臟血流量大，肝臟中濃度比較好，其他臟器因本身組織顏色較深，也沒有肝臟中血液豐富，所以直觀上沒有肝臟明顯。甘苦口服液的毒性主要來自于苦參堿，急毒試驗結(jié)果初步判斷甘苦口服液可能通過影響小鼠神經(jīng)系統(tǒng)和心

23、臟導致死亡。能使小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性交，表明神經(jīng)系統(tǒng)是其毒性靶器官;心臟血管充血和細胞有病變，表明其導致小鼠死亡的原因還可能是心肌充血。提示臨床應用時要特別注意其毒性。本研究檢測甘苦口服液小鼠口服灌胃給藥LD50為287.84mg/kg，95％可信區(qū)間為(224.08～360.08)mg/kg，為甘苦口服液臨床實驗用藥范圍提供了參考。
　　 5.藥效學試驗結(jié)果表明甘苦口服液各組能降低TAA造模大鼠血清ALT，AST，G，HA，

24、LN，PC-Ⅲ值，升高ALB值，中劑量和中劑量預防組(70mg/kg)效果更好，提示甘苦口服液抗肝纖維化機制可能是調(diào)節(jié)血清中的ALT，AST，G，HA，LN，PC-Ⅲ值。細胞因子的結(jié)果顯示甘苦口服液各組能降低TAA造模大鼠TNF-α、IL-13、TGF-β1，提示其抗肝纖維化機制還可能是調(diào)節(jié)這些細胞因子。甘苦口服液各組能降低TAA造模大鼠肝勻漿中Hyp，MDA值，升高SOD值，中劑量預防組(70mg/kg)效果最好，提示其抗肝纖維化機制