顯微注射用周脂素脂肪組織特異表達(dá)基因的制備.pdf

1、目的：
　　 為了建立周脂素（perilipin，Plin）轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)一步研究周脂素的生物學(xué)功能，闡明其在多種病理生理中的作用機(jī)制。本研究利用基因工程的方法對(duì)周脂素基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建pMDTM18-T/ap2-promoter/Plin 載體，獲得顯微注射用周脂素脂肪組織特異表達(dá)基因片段，為進(jìn)一步建立過(guò)量表達(dá)周脂素的轉(zhuǎn)基因小鼠模型奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 通過(guò)長(zhǎng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（long distance

2、 polymerae chain reaction,Long PCR），從基因組DNA中，擴(kuò)增出脂肪酸連接蛋白（fatty acid binding protein, ap2）基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游6.1kb的基因序列（包含有5.4kb ap2啟動(dòng)子序列），克隆至pMDTM18-T Vector，構(gòu)建重組載體pMDTM18-T/ ap2-promoter，Kpn I和Spe I酶切下5.4kb啟動(dòng)子序列，進(jìn)行測(cè)序鑒定。通過(guò)改進(jìn)提取脂肪組織

3、RNA的方法，從C57BL/6J附睪脂肪組織提取高質(zhì)量的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription-PCR,RT-PCR)擴(kuò)增出周脂素cDNA編碼區(qū)基因，克隆入pMDTM18-T Vector中，構(gòu)建重組載體pMDTM18-T/Plin，通過(guò)Spe I、Not I限制性內(nèi)切酶酶切后，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并與GeneBank比對(duì)。以Kpn I和Spe I雙酶切重組載體pMDTM18-T/ap2-promoter切下

4、5.4kb ap2啟動(dòng)子，再以Kpn I和Spe I雙酶切重組載體pMDTM18-T/Plin，將ap2啟動(dòng)子克隆到pMDTM18-T/Plin上游，得到轉(zhuǎn)基因載體pMDTM18-T/ap2-promoter/Plin，用限制性內(nèi)切酶Kpn I，Not I酶切，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。雙酶切重組質(zhì)粒pMDTM18-T/ap2-promoter/Plin，得到顯微注射用周脂素脂肪組織特異表達(dá)基因片段，回收純化后進(jìn)行濃度測(cè)定可用于顯微注射。

5、　　 結(jié)果：
　　 獲得的重組載體pMDTM18-T/ap2-promoter、pMDTM18-T/Plin、及轉(zhuǎn)基因載體pMDTM18-T/ap2-promoter/Plin，酶切后經(jīng)DNA電泳鑒定及DNA測(cè)序，與GeneBank當(dāng)中的序列一致。獲得的顯微注射用周脂素脂肪組織特異表達(dá)基因片段，經(jīng)濃度純度測(cè)定達(dá)到了下一步顯微注射的要求。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了脂肪組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體pMDTM18-T