豬脂肪組織特異表達(dá)基因adiponectin調(diào)控元件的功能驗(yàn)證.pdf

1、基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA,經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。而基因工程技術(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)。在基因表達(dá)中,啟動(dòng)子作為一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列,啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。目前在動(dòng)物基因工程研究中,外源基因能否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá),啟動(dòng)子是一個(gè)很關(guān)鍵的因素。這就要求對(duì)于特異性表達(dá)的基因而言,所選用的啟動(dòng)子必須具有嚴(yán)格的時(shí)空作用特異性；并且有時(shí)為了增強(qiáng)基因的特異表達(dá),還必須設(shè)計(jì)出單一型

2、增強(qiáng)子或復(fù)合型增強(qiáng)子與之匹配。本研究以豬脂肪特異性表達(dá)基因adiponectin第一外顯子之前啟動(dòng)子區(qū)域作為研究對(duì)象,從該基因啟動(dòng)子區(qū)域中轉(zhuǎn)錄活性的有效區(qū)-1671-+263中選取640bp的片段,將其命名為adi-pro。該片段中包含有一個(gè)重要的順式作用元件CRE,該位點(diǎn)與CREB蛋白結(jié)合且在人和鼠研究中并沒有被報(bào)道。之后對(duì)adi-pro調(diào)控元件進(jìn)行活性的分析,組建兩種不同的嵌合啟動(dòng)子,最終判定adi-pro調(diào)控元件的組織細(xì)胞特異性以

3、及具有高活性的嵌合啟動(dòng)子。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.以大白豬和梅山豬兩種不同豬種的DNA作為模板,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增640bp的adi-pro片段,在NCBI網(wǎng)站上對(duì)其序列進(jìn)行分析。擴(kuò)增帶有KpnⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)的adi-pro,構(gòu)建啟動(dòng)子.熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-adi-pro,分別轉(zhuǎn)染分化后的3T3-L1小鼠前體脂肪細(xì)胞以及C2C12小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞,通過所測(cè)得的熒光比值,以pGL3-Basic作為陰性對(duì)照,

4、含有adi-pro調(diào)控元件的pGL3-adi-pro載體表達(dá)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染分化后的細(xì)胞都表現(xiàn)出活性,并且相較于分化后的C2C12小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞,pGL3-adi-pro在分化后的3T3-L1小鼠前體脂肪細(xì)胞中表現(xiàn)出較高的活性；并且由轉(zhuǎn)染未分化和分化7天后的3T3-L1細(xì)胞的熒光結(jié)果得知:adi-pro調(diào)控元件在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化這一時(shí)期表現(xiàn)為活性增強(qiáng)。
　　 2.為了確定在含有SV40啟動(dòng)子與SV40增強(qiáng)子的

5、載體系統(tǒng)中adi-pro是否也同樣發(fā)揮作用,將以確定活性的adi-pro調(diào)控元件克隆入該表達(dá)載體系統(tǒng)中。將帶有KpnⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)的adi-pro調(diào)控元件基因片段克隆入pGL3-Promoter和pGL3-Enhancer載體報(bào)告系統(tǒng)中,與內(nèi)參TK質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染分化7天后的3T3-L1小鼠前提脂肪細(xì)胞,測(cè)定熒光值,以pGL3-Promoter和pGL3-Enhancer作為陰性對(duì)照,,含有adi-pro調(diào)控元件的非組成型表達(dá)系統(tǒng)p

6、GL3-Promoter-adi-pro和pGL3-Enhancer-adi-pro表現(xiàn)出較高活性。
　　 3.組建帶有強(qiáng)啟動(dòng)子CMV的CMV-adi-pro和帶有SV40增強(qiáng)子的SVenh-adi-pro這兩種嵌合啟動(dòng)子。以pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體作為模板擴(kuò)增帶有KpnⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)的CMV啟動(dòng)子基因序列,亞克隆到pGL3-Basic載體中構(gòu)建出pGL3-CMV真核表達(dá)載體；擴(kuò)增帶有MluⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的

7、adi-pro,連入到pGL3-CMV載體中,組建CMV-adi-pro。以pGL3-Enhancer真核表達(dá)載體作為模板擴(kuò)增帶有KpnⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)的SVenh增強(qiáng)子序列,用KpnⅠ和MluⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pGL3-CMV-adi-pro,酶切出CMV啟動(dòng)子序列,連入SVenh增強(qiáng)子序列,組建SVenh-adi-pro。將構(gòu)建好的質(zhì)粒分為兩組,轉(zhuǎn)染未分化和分化7天后的3T3-L1小鼠前體脂肪細(xì)胞以及C2C12小鼠骨骼肌成

8、肌細(xì)胞,測(cè)定熒光值,嵌合啟動(dòng)子CMV-adi-pro與SVenh-adi-pro較之非組成型調(diào)控元件表現(xiàn)出較高的活性；并且在嵌合啟動(dòng)子中仍然保留adi-pro調(diào)控元件在3T3-L1細(xì)胞中的特性。
　　 4.構(gòu)建adi-pro調(diào)控元件與紅色熒光蛋白的組合adi-pro-Red,以pHcRed1-N1/1載體作為模板擴(kuò)增帶有MluⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的紅色熒光蛋白R(shí)ed基因,將該基因片段亞克隆入pGL3-adi-pro真核表達(dá)載體中