二花臉豬皮下與肌內(nèi)脂肪組織基因表達(dá)譜比較及脂肪差異沉積調(diào)控機(jī)制初探.pdf

1、豬肌內(nèi)脂肪的沉積是一個復(fù)雜的生理過程。由于長期追求高瘦肉率低背膘厚的育種目的，使得肌內(nèi)脂肪含量的下降。提高肌內(nèi)脂肪含量，同時不影響其它部位脂肪的沉積成為豬育種的一個重要目標(biāo)。機(jī)體的脂肪組織被限定在特定的部位，并且不同部位的脂肪在脂肪前體細(xì)胞分化與脂肪代謝能力上存在著差異，這為尋找調(diào)控脂肪在不同組織差異沉積的分子機(jī)理提供了可能性。為了解皮下脂肪與肌內(nèi)月旨肪差異沉積的分子機(jī)制，我們首先通過基因芯片對皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較研究

2、，在此基礎(chǔ)上選擇在兩種組織差異表達(dá)、且對脂肪分化與沉積起關(guān)鍵調(diào)控作用的PPARγ基因為研究對象，從miRNA表觀調(diào)控、肌肉分泌因子調(diào)控以及核受體共激活因子影響等角度，進(jìn)一步分析組織間PPARγ表達(dá)差異的分子調(diào)控機(jī)制。
　　主要實驗結(jié)果如下:
　　1、利用Affymetrix表達(dá)譜芯片對7月齡二花臉豬胸腰接合處的皮下脂旨肪組織與背最長肌中肌內(nèi)脂肪組織的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示有1228個基因在皮下脂肪中高表達(dá)，有9

3、65個基因在肌內(nèi)脂肪中高表達(dá)。通過GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)皮下脂肪組織在脂肪代謝與脂肪酸代謝方面強(qiáng)于肌內(nèi)脂肪組織。結(jié)果顯示:脂肪分化與沉積的關(guān)鍵基因PPARγ與C/EBPα的差異表達(dá)是導(dǎo)致兩種脂肪組織代謝與脂肪沉積差異的重要原因，同時發(fā)現(xiàn)ANGPTL4、NNAT、NOR-1和CLIC5基因可能也參與了兩種組織間脂肪差異沉積的調(diào)控。
　　2、利用I型膠原酶從新生豬背最長肌中分離出肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，并通過“天花板”培養(yǎng)法獲得了肌內(nèi)脂肪去分

4、化后的后代細(xì)胞。這類成纖維狀后代細(xì)胞在體外經(jīng)成脂誘導(dǎo)后可以發(fā)生再分化，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中聚集脂肪滴，并高表達(dá)生脂相關(guān)基因。通過該技術(shù)可以穩(wěn)定地獲得豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞去分化的細(xì)胞(dedifferentiatedfatcells，DFAT細(xì)胞)，并且DFAT細(xì)胞可作為肌內(nèi)脂肪分化與代謝研究的細(xì)胞模型。
　　3、為了研究脂肪在皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪中差異沉積的分子機(jī)理，我們比較了脂肪分化與聚集的關(guān)鍵基因PPARγ在這兩種組織中表達(dá)的差異。并檢測了

5、靶向PPARγ的miRNA在這兩種組織中的表達(dá)量，對差異表達(dá)的miRNA，通過雙熒光報告系統(tǒng)進(jìn)行靶向性驗證。通過在肌內(nèi)DFAT細(xì)胞中超表達(dá)miRNA來研究其對肌內(nèi)脂肪DFAT細(xì)胞的成脂分化與脂肪聚集的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)脂肪PPARγ的mRNA與蛋白水平顯著低于其在皮下脂肪中的表達(dá)量。在生物信息學(xué)預(yù)測的靶向PPARγ的miRNA中，miR-128與miR-130a在肌內(nèi)脂肪中顯著高表達(dá)。經(jīng)實驗驗證發(fā)現(xiàn)，只有miR-130a可以靶向PPAR

6、γ的3'-UTR。在肌內(nèi)DFAT細(xì)胞中超表達(dá)miR-130a，可以通過抑制PPARγ的表達(dá)來抑制肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的成脂分化。結(jié)果表明，組織間miR-130a的差異導(dǎo)致了PPARγ在肌內(nèi)與皮下脂肪中的差異表達(dá)，這可能是影響兩種脂肪組織差異沉積的重要因素。
　　4、用含有肌肉組織培養(yǎng)液的誘導(dǎo)液可以顯著抑制肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的成脂分化，從而推測肌纖維可以分泌抑制肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的因子。之前報道肌肉生長抑制素(MSTN)可以影響脂肪細(xì)胞的分

7、化，所以我們針對MSTN對肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的影響做了進(jìn)一步研究。用不同濃度的MSTN處理肌內(nèi)DFAT細(xì)胞，檢測其對肌內(nèi)DFAT細(xì)胞增殖與分化的影響。通過對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞添加MSTN，檢測其對肌內(nèi)脂肪脂解能力的影響。通過檢測肌肉組織中MSTNmRNA表達(dá)量以及血清中MSTN蛋白含量，分析其與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系。結(jié)果顯示，不同濃度的MSTN對肌內(nèi)DFAT細(xì)胞增殖的作用不同，100ng/ml的MSTN可以促進(jìn)肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的增殖，低于100n

8、g/ml的MSTN則抑制肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的增殖。MSTN以濃度依賴的方式抑制肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的成脂分化與脂滴聚集。MSTN可以通過抑制脂肪分化關(guān)鍵基因C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ、SREBP1c的表達(dá)來抑制肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的成脂分化。通過檢測培養(yǎng)基中甘油的釋放量及脂解關(guān)鍵基因的表達(dá)來檢測MSTN對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂解能力的影響，結(jié)果顯示MSTN對于成熟的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞可以通過抑制ATGL與HSL的表達(dá)來抑制脂肪分解。在體實驗發(fā)現(xiàn)MS

9、TN的mRNA表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量無關(guān)，血清中MSTN總蛋白含量與肌內(nèi)脂肪含量的高低無關(guān)。
　　5、作為PPARγ重要的共激活因子，SRC-2通過與PPARγ的協(xié)同作用發(fā)揮對脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用。為驗證SRC-2在肌內(nèi)DFAT細(xì)胞分化的作用，我們通過siRNA干擾敲低SRC-2的表達(dá)，觀察肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的成脂分化能力。同過RT-qPCR與油紅O染色檢測，發(fā)現(xiàn)干擾SRC-2后可以顯著抑制肌內(nèi)DFAT細(xì)胞的成脂分化，并且顯著降低P