豬肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪的糖皮質(zhì)激素敏感性差異及其機理初探.pdf

1、肌內(nèi)脂肪含量是影響豬肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，對豬肉多汁性、嫩度、風(fēng)味等食用品質(zhì)具有重要的影響，提高肌內(nèi)脂肪含量是改善豬肉品質(zhì)的重要途徑。然而，肌內(nèi)脂肪與皮下脂肪的沉積呈現(xiàn)一定正相關(guān)性。因此，明確肌肉脂肪特有的生理特性和調(diào)控方式是實現(xiàn)肌內(nèi)脂肪特異性調(diào)控的前提。糖皮質(zhì)激素對脂肪沉積具有明顯的促進作用，能夠誘導(dǎo)前體脂肪細胞的增殖和分化。已有研究表明，糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性差異是導(dǎo)致組織間脂肪沉積差異的重要原因。本研究首先對豬皮下脂肪與肌肉脂肪對糖皮質(zhì)激素

2、反應(yīng)性的差異進行探討。在此基礎(chǔ)上，通過肌肉組織培養(yǎng)液以及肌肉與脂肪細胞共培養(yǎng)等方法，從肌肉對脂肪細胞影響的角度進一步探索肌內(nèi)與皮下脂肪組織對糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性存在差異的機制，并尋找影響脂肪細胞糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性的肌肉因子，以期揭示肌肉脂肪獨特的調(diào)控方式，為特異性提高肌內(nèi)脂肪含量奠定基礎(chǔ)。
　　具體結(jié)果如下:
　　1.皮下與肌內(nèi)脂肪細胞對糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性差異研究
　　使用不同濃度的糖皮質(zhì)激素類似物-地塞米松(DEX)處理皮下

3、、肌內(nèi)前體脂肪細胞，CCK8法檢測細胞活力。結(jié)果顯示，DEX促進了兩種前體脂肪細胞的增殖，在24、48、72小時，100nM的DEX對皮下前體脂肪細胞的促進作用顯著高于肌內(nèi)前體脂肪細胞（P＜0.05）。使用2.5μM的DEX誘導(dǎo)脂肪細胞分化，檢測細胞內(nèi)甘油三酯(TG)水平，發(fā)現(xiàn)DEX對皮下前體脂肪細胞中TG積聚的促進作用比肌內(nèi)脂肪細胞高29％（P＜0.05）。
　　采用DEX處理皮下或肌內(nèi)成熟脂肪細胞，結(jié)果表明兩種細胞中TG均無顯

4、著增加，而脂肪的分解水平顯著增加（P＜0.05），但兩種細胞間無顯著差異。胰島素(INS)具有與DEX協(xié)同作用促進脂肪沉積的功能，DEX與INS聯(lián)用能夠增加成熟脂肪細胞中TG的積聚，并抑制脂肪的分解;對皮下成熟脂肪細胞中TG積聚的促進作用和對脂解的抑制作用均顯著高于肌內(nèi)脂肪細胞（P＜0.05）。
　　采用促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH（可促進內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的釋放）處理14頭母豬，研究在體水平皮下脂肪組織(SAT)和肌內(nèi)脂肪組織(IMA

5、T)對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，ACTH處理顯著促進了SAT和IMAT中脂肪合成標志基因FASN、STAT5、SRC2和SRC3的表達，并且對SAT的促進作用顯著高于IMAT（P＜0.05）。ACTH處理顯著促進了兩種脂肪組織中脂肪分解標志基因ATGL和HSL的表達，并且對SAT的促進作用顯著高于IMAT（P＜0.05）。結(jié)果表明，皮下脂肪對內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)性強于肌內(nèi)脂肪。
　　2.皮下與肌內(nèi)脂肪組織糖皮質(zhì)激素受體水平差

6、異的研究
　　為探究糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性差異的機理，檢測了糖皮質(zhì)激素受體(GR)在皮下脂肪組織(SAT)、肌內(nèi)脂肪組織(IMAT)中的表達模式。結(jié)果顯示SAT中GR功能亞型GRα的mRNA水平是IMAT的2.2倍（P＜0.05）。
　　為分析SAT和IMAT中GRα水平差異的原因，對GR基因的9種Exon1變體進行檢測，結(jié)果顯示，變體E1-C的表達豐度最高，占GR總mRNA比例的65％～76％，因此GR總水平受E1-C的影響最大

7、;變體E1-F、E1-D、E1-B、E1-A、E1-H具有中等的表達豐度(1.6％～10.2％);E1-E、E1-J、E1-G的表達豐度較低(0.4％～2.8％)。SAT中變體E1-A，E1-C和E1-H的水平顯著高于IMAT(P＜0.05)。
　　進一步檢測9種Exon1變體在GRα和GRβ亞型中的表達比例，結(jié)果顯示，變體E1-A，和E1-B在GRβ中的表達比例顯著高于GRα(P＜0.05)，表明E1-A和E1-B更多的影響GR

8、β的表達;而變體E1-H只在GRα中表達，表明變體E1-H轉(zhuǎn)錄本只編碼GRα亞型，并且SAT中E1-H的水平是IMAT的1.9倍，差異顯著（P＜0.05）。因此，SAT比IMAT具有較高GRα水平的主要原因，是由于其具有較高水平的最主要變體E1-C和GRα特異變體E1-H。
　　3.肌肉組織培養(yǎng)液通過抑制GRα的表達影響脂肪細胞的增殖分化和凋亡
　　基于肌內(nèi)脂肪所處的特殊位置，假設(shè)肌肉能夠抑制GRα的水平從而影響肌內(nèi)脂肪的糖

9、皮質(zhì)激素反應(yīng)性。使用肌肉組織培養(yǎng)液(TCF)處理前體脂肪細胞，GR變體E1-C和E1-H表達水平分別降低了32％和73％，GRα的水平下調(diào)了46％，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。
　　細胞計數(shù)結(jié)果顯示，TCF處理抑制了前體脂肪的增殖，與對照組相比細胞數(shù)目減少了41％(P＜0.01); GR的拮抗劑RU486對脂肪細胞的增殖具有類似的抑制效果，使脂肪細胞數(shù)目減少了38％（P＜0.01）;DEX處理能夠部分挽救TCF對脂肪細胞

10、增殖的抑制作用，TCF+DEX組細胞數(shù)目極顯著高于TCF組（P＜0.01）。油紅O染色及細胞中TG含量測定結(jié)果顯示TCF顯著抑制了前體脂肪細胞的分化，TG的沉積量減少了45％（P＜0.01）。
　　流式細胞儀檢測前體脂肪細胞周期，結(jié)果顯示TCF將前體脂肪細胞阻滯在了G2-M期，G2-M期的細胞增加了60％，而G0-G1期的細胞減少了23％; RU486對細胞周期具有類似的作用，使G2-M期的細胞增加了38％，G0-G1期細胞減少了

11、14％;在TCF中加入DEX能夠部分挽救TCF對細胞周期的抑制作用（P＜0.01）。
　　流式細胞儀檢測皮下前體脂肪細胞的凋亡，結(jié)果顯示，TCF促進了前體脂肪細胞的凋亡，晚期凋亡率增加3.3倍，細胞壞死率增加8倍;RU486對前體脂肪細胞凋亡具有類似的促進作用，晚期凋亡率增加2.4倍，細胞壞死率增加6.8倍;而DEX能夠挽救TCF的作用（P＜0.01）。
　　4.C2C12肌管通過抑制GRα影響3T3-L1脂肪細胞的增殖分化

12、和凋亡
　　利用Trans-well小室建立C2C12成肌細胞與3T3-L1前體脂肪細胞共培養(yǎng)模型，研究成熟肌管對脂肪細胞增殖分化以及凋亡的影響。細胞計數(shù)及EdU染色結(jié)果表明，C2C12成熟肌管顯著抑制3T3-L1前體脂肪細胞的增殖，細胞總數(shù)減少了34％，EdU陰性細胞數(shù)增加了89％，與對照組相比差異顯著（P＜0.01）。油紅O染色以及TG含量測定結(jié)果表明，C2C12肌管顯著抑制了脂肪細胞的分化，細胞中TG沉積量減少了39％（P＜

13、0.01）。同時，C2C12肌管引起3T3-L1前體脂肪細胞中Caspase3活性顯著增加，早期凋亡的細胞比例從3.8％上升到14.1％，晚期凋亡的細胞比例從6.8％上升到9.1％（P＜0.01）。
　　進一步研究C2C12對3T3-L1脂肪細胞中GRα水平以及糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性的影響。檢測GRα的mRNA和蛋白水平發(fā)現(xiàn)，C2C12顯著抑制了3T3-L1細胞中的GRα水平（P＜0.01）。檢測共培養(yǎng)前后3T3-L1脂肪細胞中增殖、分

14、化以及凋亡關(guān)鍵基因?qū)EX的反應(yīng)性，結(jié)果表明C2C12肌管顯著抑制了3T3-L1細胞中增殖標志基因Cyclin D與脂肪分化標志基因PPARγ，促進了凋亡標志基因FAS的表達(P＜0.01)。DEX能夠部分挽救C2C12對3T3-L1的作用，但是無法將共培養(yǎng)組3T3-L1細胞中的Cyclin D、PPARγ和FAS恢復(fù)到與對照組同樣的水平。表明C2C12肌管降低了3T3-L1前體脂肪細胞的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性，抑制3T3-L1細胞的增殖、分

15、化，促進了其凋亡，驗證了肌肉組織培養(yǎng)液的結(jié)果。
　　5.肌肉生長抑制素抑制了脂肪細胞中GRα的表達，影響脂肪細胞的增殖和凋亡使用肌肉分泌因子肌肉生長抑制素(MSTN)處理脂肪細胞，GRα和變體E1-C、E1-H的mRNA水平分別降低了36％、35％和33％, GRα蛋白水平降低了24％，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。CCK8法與EdU染色檢測細胞增殖，結(jié)果顯示MSTN抑制了脂肪細胞的增殖，細胞活力顯著降低，EdU陰性細胞的

16、比例增加了1.83倍（P＜0.01）。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示G0-G1期的細胞增加了8.3％，S期的細胞減少了5.1％，差異顯著(P＜0.05);細胞凋亡檢測結(jié)果顯示早期和晚期凋亡率分別增加了220％和90％，差異極顯著（P＜0.01）。
　　6.肌肉生長抑制素上調(diào)E1-C和E1-H啟動子的甲基化水平，抑制GRα的表達
　　GR基因啟動子區(qū)的DNA甲基化會抑制其表達，此外，有研究報道MSTN能夠調(diào)控脂肪細胞的DNA甲基化。亞

17、硫酸鹽測序結(jié)果表明，在檢測到的甲基化修飾位點中，變體E1-C的啟動子在肌肉脂肪組織中的整體甲基化水平為66％，顯著高于皮下脂肪中的46％(P＜0.05);E1-H啟動子的整體甲基化水平為15％，顯著高于皮下脂肪中的9％（P＜0.05）。其中，CpG8、CpG14、CpG30、CpG37和CpG38位點在皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪中表現(xiàn)出明顯不同的甲基化狀態(tài)（P＜0.05）。通過DNA甲基免疫沉淀(MeDIP)檢測了MSTN對脂肪細胞中E1-C和

18、E1-H啟動子甲基化水平的影響，結(jié)果表明MSTN處理使E1-C啟動子甲基化水平由15％升至29％，差異顯著(P＜0.05)，E1-H啟動子的甲基化水平由15％升至26％，差異極顯著(P＜0.01)。
　　綜上所述，肌肉通過抑制GR變體E1-C和E1-H的表達，造成肌內(nèi)脂肪組織中GRα水平下降，降低了其糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性，阻礙了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的促增殖、促分化和抗凋亡作用，最終抑制了肌內(nèi)脂肪的沉積。而肌肉因子MSTN是其中發(fā)揮作用的因子