轉(zhuǎn)錄因子MEF2A、KLF2在血管性疾病中的臨床和基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　一、轉(zhuǎn)錄因子MEF2A基因突變與中國(guó)冠心病家系研究
　　目的：
　　1.根據(jù)冠心病、心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，在中國(guó)早發(fā)冠心病人群中篩選合適病例，進(jìn)行家系調(diào)查，選擇理想的CAD/MI家系;
　　2.研究分析冠心病家系的遺傳特征、傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素、脂類代謝情況、冠狀動(dòng)脈病變情況;
　　3.進(jìn)行家系全基因組連鎖分析，篩選CAD/MI候選基因，基因測(cè)序，尋找有意義的基因突變;
　　4.

2、研究中國(guó)冠心病家系中MEF2A基因第1-11外顯子的基因突變情況，與散發(fā)冠心病及健康人群對(duì)照，分析MEF2A基因突變與我國(guó)CAD/MI家系的關(guān)系。
　　方法：
　　1.通過(guò)病案檢索臨床診斷明確的早發(fā)冠心病患者，進(jìn)行家系調(diào)查，篩選符合顯性遺傳特征的家系作為研究對(duì)象。研究采用的冠心病或心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)為下述條件中至少存在兩個(gè):(1)胸痛;(2)心電圖改變符合急性心肌梗死演變并與心肌酶/肌鈣蛋白顯著升高相一致;(3)冠狀動(dòng)脈CT

3、或冠狀動(dòng)脈造影血管腔直徑狹窄率超過(guò)50％。通過(guò)篩選，確定研究家系。所有的家系成員均進(jìn)行體格檢查、血液分析檢驗(yàn)（血常規(guī)、肝腎功、血糖、血脂及血離子分析）、冠狀動(dòng)脈病變?cè)u(píng)估，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的隨訪，包括病史、活動(dòng)耐力、藥物史和個(gè)人的生活習(xí)慣。
　　2.收集以首發(fā)心肌梗死入院并行冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)血管病變的散發(fā)冠心病患者(n=311)作為散發(fā)CAD對(duì)照組;健康對(duì)照組(n=323)是經(jīng)過(guò)冠脈造影或冠狀動(dòng)脈CT排除冠心病的健康人群，且無(wú)早發(fā)冠

4、心病家族史。
　　3.微陣列比較基因組雜交(aCGH)分析:利用全血DNA提取試劑盒提取所有受試者的基因組DNA。aCGH分析冠心病家系中CAD/MI患者樣本中的DNA，正常人基因組DNA作為一個(gè)參考，我們用間隔5-kb的寡核苷酸微陣列高精度覆蓋整個(gè)基因組，拷貝數(shù)變異由患者cDNA樣本與正常對(duì)照之間log2比值確定。
　　4.MEF2A基因檢測(cè):采用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增所有家系成員MEF2A基因所有外顯子和內(nèi)含子-外顯子

5、邊界區(qū)域。引物序列包括MEF2A基因外顯子1-11。利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，出現(xiàn)異常條帶的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM T easy載體擴(kuò)增，使用ABI3100遺傳分析儀測(cè)序，與CAD對(duì)照組、正常對(duì)照組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析。
　　結(jié)果：
　　1.成功篩選并確定了一個(gè)有34個(gè)家庭成員（5人死亡）的CAD/MI大家系，共包括20名女性和14名男性，該家系四代均無(wú)近親婚配。先證者是一名女性，36歲發(fā)病，冠

6、狀動(dòng)脈造影(CAG)顯示嚴(yán)重前降支病變，狹窄超過(guò)80％，無(wú)吸煙、高血壓、糖尿病及高脂血癥，符合早發(fā)冠心病診斷。此家系共發(fā)現(xiàn)7名現(xiàn)存活的CAD/MI患者，包括先證者的母親、兩個(gè)姐姐，一個(gè)哥哥、表哥和侄女均有早發(fā)冠心病(PCAD)癥狀及表現(xiàn)。
　　2.家系成員CAD危險(xiǎn)因素分析示:家庭中僅有幾個(gè)成員有血清總膽固醇和甘油三酯輕度升高，但血清低密度和高密度脂蛋白均正常，家庭成員均沒(méi)有吸煙、高血壓病、糖尿病和肥胖病史。多元Logistic回

7、歸分析家系成員的年齡、體重指數(shù)、膽固醇、甘油三酯水平、空腹血糖等因素與CAD/MI均無(wú)相關(guān)性。
　　3.家系具有以下遺傳特點(diǎn):我們分析該家系的CAD/MI遺傳特點(diǎn)為:發(fā)病不分男女性別，符合常染色體遺傳;4代人均有發(fā)病，第3代患病人數(shù)達(dá)55.6％(5/9)，患者雙親中必有一方也患病，正常親屬后代未發(fā)病，這些特點(diǎn)符合顯性遺傳特點(diǎn)。
　　4.微陣列CGH分析:家系中7例CAD/MI患者的染色體15q26中都存在50-kb的片段染色

8、體拷貝數(shù)差異(log2 ratio means＜-0.3)，這一區(qū)域包含11個(gè)重要的基因(POTEB, CXADRP2, LOC646214, GOLGA8C, OR4M2, OR4N4, LOC650137, MEF2A,OR4F4,WASH3P and FAM138E)，經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)其中只有MEF2A基因與CAD的發(fā)病相關(guān)，MEF2A成為最強(qiáng)的候選基因。
　　5.MEF2A基因檢測(cè):(1)在家系的所有成員MEF2A基因的第1

9、、2、3、4、5、6、7、8、9、10外顯子SSCP分析均未發(fā)現(xiàn)有異常條帶;(2)在家系的所有7個(gè)CAD/MI患者和非CAD/MI的5個(gè)成員基因檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)MEF2A第11外顯子存在6個(gè)堿基對(duì)(CAGCCG)缺失;(3)這6個(gè)堿基對(duì)(bp)缺失位于MEF2A基因cDNA序列的1671至1676位置;(4)第11外顯子缺失的序列之中含一個(gè)CAG序列，其前方還有n個(gè)CAG重復(fù)序列;(5)家系中沒(méi)有6-bp缺失的成員均為正常表型，未發(fā)生CAD，

10、其他存在6-bp缺失而未發(fā)生冠心病的5名家庭成員均未滿40歲;(6) CAD對(duì)照組311個(gè)CAD患者和正常對(duì)照組323健康人的MEF2A基因外顯子11編碼區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)6-bp缺失，也未發(fā)現(xiàn)國(guó)外研究報(bào)道過(guò)的21-bp缺失。
　　結(jié)論：
　　1.本研究成功篩選出具有顯性遺傳特征的中國(guó)冠心病家系，年齡、血壓、吸煙、血脂、血糖、體重指數(shù)等常見危險(xiǎn)因素與家系成員冠心病發(fā)生無(wú)相關(guān)性，證明家族遺傳因素是部分人群冠心病發(fā)生的重要原因。

11、>　　2.首次在中國(guó)家系研究中發(fā)現(xiàn)一種家族遺傳型冠心病與新發(fā)現(xiàn)的MEF2A基因突變密切相關(guān)，這種突變是位于MEF2A基因的第11外顯子6堿基(CAGCCG)缺失，是人類MEF2A基因中發(fā)現(xiàn)一種新的突變類型。
　　3.本研究在散發(fā)CAD及正常對(duì)照組人群中未發(fā)現(xiàn)MEF2A基因的第11外顯子6堿基(CAGCCG)缺失以及國(guó)外研究報(bào)道過(guò)的21-bp缺失，我們認(rèn)為MEF2A基因第11外顯子突變與我國(guó)散發(fā)冠心病的發(fā)生無(wú)關(guān)，可能是部分CAD家系

12、的致病基因。
　　二、轉(zhuǎn)錄因子KLF2在高糖條件下對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響及藥物干預(yù)研究
　　目的：
　　通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討轉(zhuǎn)錄因子KLF2在高糖條件下是否對(duì)血管內(nèi)皮功能具有重要的保護(hù)作用，闡明可能的分子機(jī)制及干預(yù)措施，為防治糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化提供重要治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及存活率測(cè)定:
　　離體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，用不同濃度梯度及時(shí)間梯度的高糖干預(yù)，MTT比色法測(cè)定細(xì)胞

13、存活率最終確定高糖誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞模型為25.5mmol/L的D-葡萄糖誘導(dǎo)24h。
　　2.細(xì)胞干預(yù):
　　采用25.5mmol/L高糖及不同濃度阿托伐他汀、羅格列酮實(shí)現(xiàn)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞KLF2表達(dá)的干預(yù)，以SB203580來(lái)抑制p38MAPK活性，分別采用5.6mmol/L葡萄糖、5.6mmol/L葡萄糖+19.9 mM甘露醇干預(yù)細(xì)胞作對(duì)照組。
　　3.RT-PCR:
　　收集各組細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行逆

14、轉(zhuǎn)錄和定量PCR，分別檢測(cè)各組細(xì)胞中KLF2、PPARγ、VCAM-1和ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平。
　　4.Western blotting:
　　收集各組細(xì)胞，提取蛋白，分別檢測(cè)KLF2、VCAM-1、ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK、PPARγ的蛋白表達(dá)水平。
　　5.NO檢測(cè):
　　收集各組細(xì)胞上清液，采用試劑盒檢測(cè)NO釋放。
　　結(jié)果：
　　1.與5.6mmol/L葡萄

15、糖及5.6mmol/L葡萄糖+甘露醇組對(duì)照，25.5mmol/L高糖刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h可明顯減低KLF2mRNA及蛋白的表達(dá)，增高炎性因子VCAM-1、 ICAM-1水平，減少NO的釋放，KLF2與VCAM-1、ICAM-1、NO變化趨勢(shì)顯著相關(guān);
　　2.以阿托伐他汀(0.1μM，1μM，10μM)、羅格列酮(0.1州，1μM，10μM)分別干預(yù)高糖刺激的HUVECs能明顯增加KLF2表達(dá)和NO的釋放，降低VCAM-1、I

16、CAM-1蛋白和mRNA表達(dá)，這種改變?cè)诎⑼蟹ニ〗M呈劑量依賴性，藥物濃度越高越明顯;
　　3.與對(duì)照組比較，高糖刺激后的HUVECs磷酸化的p38 MAPK表達(dá)增強(qiáng)，給與p38MAPK特異性抑制劑SB203580后，KLF2的表達(dá)增加;中等濃度阿托伐他汀、羅格列酮（1μM）就能明顯抑制高糖對(duì)HUVEC p38 MAPK的磷酸化作用。
　　結(jié)論：
　　1.高濃度葡萄糖能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥因子VCAM-1、ICA