慢性阻塞性肺疾病中轉(zhuǎn)錄因子ATF3-ATF4和KLF2在Nrf2-γ-GCS通路中的作用及意義.pdf

1、【目的】研究轉(zhuǎn)錄因子ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2及γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠及患者肺組織中的表達變化關(guān)系;探討 ATF3、ATF4、KLF2與Nrf2蛋白之間的相互作用,以及對γ-GCS-HS基因表達的影響;探索它們在COPD發(fā)病中的可能作用,為COPD的防治提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】實驗分兩部分。(1)動物試驗部分:將22只雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和COPD模型組,每組11只。采用每

2、日熏香煙和兩次氣管內(nèi)滴入脂多糖(LPS)復(fù)制 COPD大鼠模型。檢測各組大鼠肺功能并觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學改變;原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測肺組織ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA的表達。免疫組化和免疫印跡(Western blot)分別檢測ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表達水平。并同時利用免疫共沉淀法(CO-IP)探討ATF3、ATF4、KLF2與N

3、rf2蛋白之間的相互作用。(2)臨床試驗部分:肺癌患者手術(shù)切除肺組織標本40例,所有患者術(shù)前均詢問病史,進行體檢、X線胸片或肺部 CT和肺功能檢測,其中COPD組和對照組各20例。原位雜交分析各組患者肺組織中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA水平,免疫組化檢測肺組織中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白的表達。
　　【結(jié)果】
　　1.動物試驗結(jié)果
　　(1)大鼠肺

4、功能指標(FEV0.3、FEV0.3/FVC％、PEF)在COPD組較對照組明顯降低(P均<0.01)。COPD組大鼠肺部病理改變符合COPD的形態(tài)學改變。
　　(2) ROS含量在COPD組較對照組顯著增高(P<0.01),γ-GCS-HS活性在COPD組較對照組顯著升高(P<0.01)。
　　(3)原位雜交結(jié)果顯示:ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA在兩組大鼠肺組織中的表達部位基本一致,主

5、要見于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、平滑肌細胞以及血管內(nèi)皮細胞,且ATF3、ATF4、KLF2、γ-GCS-HS mRNA在COPD組顯著高于對照組(P均<0.05)但兩組Nrf2 mRNA比較無明顯差異(P>0.05)。RT-PCR結(jié)果與原位雜交結(jié)果一致。
　　(4)免疫組化結(jié)果顯示:ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS主要表達于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞,小血管平滑肌中亦有少許表達。ATF3、ATF4、K

6、LF2、Nrf2在COPD組以胞核表達為主,γ-GCS-HS在胞漿胞核均有免疫著色,其差異具顯著性(P均<0.05)。Western blotting結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致(P均<0.05)。
　　(5)免疫共沉淀顯示:在 Nrf2抗體捕獲的免疫沉淀中,ATF3、ATF4、KLF2抗體均可雜交出明顯的蛋白條帶,且COPD組明顯增強(P<0.01)。
　　(6) SPSS16.0軟件行直線相關(guān)分析:大鼠肺組織中ATF3、ATF

7、4、KLF2、Nrf2蛋白表達與γ-GCS-HS mRNA、蛋白及酶活性均呈正相關(guān)(均P<0.05);ATF3、ATF4、KLF2蛋白表達與Nrf2蛋白表達均呈正相關(guān)(均P<0.05);ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2蛋白表達與 ROS呈正相關(guān)(均P<0.05)。
　　2.臨床試驗結(jié)果
　　(1) COPD患者肺組織中ATF3、ATF4、KLF2、γ-GCS-HS mRNA呈強陽性表達,較對照組顯著升高(均P<0.01

8、),而Nrf2 mRNA在兩組肺組織中均呈陽性表達,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　(2) ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白在COPD患者肺組織中呈強陽性表達,較對照組明顯增高(均P<0.01)。
　　(3) SPSS16.0軟件行直線相關(guān)分析:ATF3、ATF4、KLF2蛋白表達與Nrf2蛋白、γ-GCS-HS mRNA及蛋白表達均呈明顯正相關(guān)(均P<0.01),而與Nrf2 m

9、RNA表達無明顯相關(guān)性(P>0.05)。另肺組織中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表達與FEV1(%)、FEV1/FVC(%)均呈正相關(guān)(均P<0.01)。
　　【結(jié)論】
　　1.在COPD氧化應(yīng)激狀況下,體內(nèi)重要抗氧化酶γ-GCS可代償性上調(diào),而Nrf2是γ-GCS表達上調(diào)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,可增加GSH合成,降低ROS,對抗氧化損傷。
　　2.在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病過程中,氧化應(yīng)激誘導轉(zhuǎn)