KLF4和miR27b在血管疾病中的功能和分子機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第一章:KLF4在HRMECs中的功能和分子機制的研究
　　目的：
　　血管再生是發(fā)育過程中已有血管生成新血管的生理過程，在胚胎發(fā)育過程中具有重要的作用。人們廣泛地研究了血管再生在很多疾病中的治療效果，通過抑制血管生成或者促新血管生成藥物來控制血管再生。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種血管增生因子。通過激活VEGF信號通路，可有效促進血管再生。在臨床上，VEGF抗體或者VEGF受

2、體(VEGFR)激酶抑制劑哌加他尼鈉、蘭尼單抗及貝伐單抗等已被批準應用，用來治療癌癥、年齡相關性黃斑變性及糖尿病性視網(wǎng)膜病變。雖然在治療過程中出現(xiàn)了一定的療效，但一些副作用依然頻發(fā)，如:慢性皮膚型紅斑狼瘡及眼內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤等。因此，還需要對VEGF信號通路在這些疾病中的作用規(guī)律進行進一步的研究。轉錄因子Krüppel樣因子4(KLF4)，是能夠?qū)⒊赡晷图毎鼐幊烧T導多能干細胞(iPSCs)的四大因子之一;在重新編碼過程中

3、，KLF4通過抑制上皮向間充質(zhì)細胞的轉化(EMT)而發(fā)揮著作用。KLF4作用下的EMT與腫瘤轉移存在一定的關聯(lián)，對此人們已在幾種人類癌癥中進行廣泛的研究。通過瞄準VEGF通路，EMT可促進血管再生。在維持內(nèi)皮祖細胞表型的過程中，KLF4是關鍵的調(diào)節(jié)因子;通過激活AKT通路，白血病抑制因子和血管內(nèi)皮生長因子能夠上調(diào)KLF4。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，KLF4通過調(diào)節(jié)miR-15a來抑制細胞周期蛋白D1，削弱內(nèi)皮細胞中的管狀形成。然而另外一項調(diào)查結

4、果則顯示，通過調(diào)節(jié)notch信號通路KLF4能夠促進內(nèi)皮細胞中的血管再生。在基因表達譜上，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)和人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（HRMECs）各自具有不同的特性。轉錄因子Krüppel-like factor4(KLF4)對人類細胞的細胞增殖、遷移和分化起到了調(diào)節(jié)的作用，并且是誘導干細胞重組的四個因素之一，然而，它在眼部新生血管性疾病中的作用還沒有探明。本實驗的目的是探討其在HRMECs血管生成中的作用和潛在的分子機

5、制。
　　方法：
　　細胞培養(yǎng):HRMECs在Cell Systems(Kirkland，WA)購買，Medium131作為基礎培養(yǎng)基，其中加入了10％的FBS，1％的微血管生長因子添加劑，10μg/ml慶大霉素，100 U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。在37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有的實驗都在細胞培養(yǎng)五代之內(nèi)進行。慢病毒載體的構建:本課題中，KLF4過表達慢病毒載體的構建參照分子克隆的標準方法完成。KLF4

6、shR1和KLF4shR2在GE Dharmacon(Lafayette，CO)購買。shRNA作用KLF4的目標序列為5'GCTCCATTACCA AGA GCTCAT(KLF4shR1)和5'GCCAGAATTGGACCCG GTGTA(KLF4shR2)，對照pLKO1-scrambe(＃1864)在Addgene(Cambridge，MA)購買。HEK293FT細胞包裝慢病毒。純化后的慢病毒轉染HRMECs，3μg/ml嘌呤霉素

7、篩選轉染48小時后的細胞。MTT分析:96孔板每孔接種5000個細胞，含1％FBS的培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12小時后VEGF(50ng/ml)處理。此后，96孔板中，每個孔加入10μl MTT反應物，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時后加入100μl的detergent來終止反應，測量570 nm的OD值來反映細胞的增殖情況。細胞遷移實驗:使用購買于BD Science(Franklin Lakes，NJ)公司的細胞遷移室進行細胞遷移實驗。細胞遷移室置入24孔

8、板內(nèi)。300μL M131中包含2×104個細胞，加入到每個遷移室的上部。終濃度為50 ng/ml的VEGF作為誘導因子添加到每個小室的底部。培養(yǎng)基和未遷移的細胞被隔離在小室的上層，內(nèi)置遷移室的24孔板培養(yǎng)在5％二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)12小時。在薄膜底部遷移的細胞用甲醇固定，結晶紫染色，倒置顯微鏡拍攝圖片。遷移細胞數(shù)從三個不同的區(qū)域統(tǒng)計，計算遷移率。血管形成分析:基底膜基質(zhì)TM(BD Biosciences)在4℃過夜解凍，在每個96孑L板中

9、加入60μl。聚合反應的條件是37℃，30 min。無VEGF處理的細胞在M131培養(yǎng)基中重懸，調(diào)整細胞數(shù)量后接種在凝膠的上部，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小時。每孔中選擇3個視野計算管狀結構的分支點和分枝數(shù)，分析作圖。熒光素酶報告基因分析:1.5kb和0.2 kb Vegf啟動子報告載體和帶有KLF4 Tet-on的慢病毒載體共同轉染HRMECs，PSV40 Rellina質(zhì)粒作為內(nèi)參質(zhì)粒。1 ug/ml DOX誘導KLF4表達。firefly熒

10、光素酶和renilla熒光素酶底物在轉染后24小時后分別測量，計算firefly熒光素酶和renilla熒光素酶表達的比例。免疫熒光染色:為檢驗HRMECs中VEGF和KLF4的表達，KLF4表達細胞和對照組細胞用4％ PFA固定10分鐘，含0.1％ Tween20的PBS洗3次，封閉液（5％的正常山羊血清，3％牛血清白蛋白，包含0.1％ Triton-X100的PBS）孵育1小時。VEGF和KLF4的抗體稀釋液孵育過夜，PBST沖洗3

11、次×5分鐘后，室溫下，二抗稀釋液孵育1小時。DAPI進行細胞核復染色，尼康倒置熒光顯微鏡采集圖像。Western Blot: HRMECs總蛋白的提取，取等量的蛋白(30μ g/lane)進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將其轉移到硝酸纖維素膜上，封閉膜，一抗二抗孵育膜，在sigma公司(St.Louis，MO)購買GAPDH的一抗，在Cell Signaling購買P-ERK1/2，P-AKT，p-VEGFR2的一抗。
　　結論

12、：
　　KLF4結合Vegf啟動子區(qū)域，上調(diào)Vegf表達。
　　KLF4增強HRMECs中VEGF介導的信號通路，激活VEGFR2和下游ERK1/2、AKT信號通路。
　　KLF4促進HRMECs的增殖、遷移和微管形成。
　　第二章:miR-27b在MVSMCs中的功能和分子機制的研究
　　目的：
　　近年來，miRNA是生物學研究的熱點，生物體內(nèi)許多生理、病理過程都與miRNA直接相關。miRNA在

13、進化過程中具有高度保守的特點，是一種內(nèi)源性非編碼RNA，在轉錄后水平抑制基因的表達，參與生物的代謝，并且在代謝中發(fā)揮重要作用。miRNA在促進血管平滑肌細胞(VSMCs)表型變化的過程中，發(fā)揮著重要的功能，但對其發(fā)揮功能的內(nèi)在分子機制，依然不是十分明確。編碼miR-27b的基因位于第9染色體，在人類和小鼠中，miR-27b基因序列保守，在腫瘤中的研究表明，miR-27b對胃癌細胞的生長和遷移具有抑制作用，但對乳腺癌和宮頸癌細胞的增殖有促

14、進作用。在正常的生理情況下，miR-27b調(diào)節(jié)肌肉脂肪細胞的分化，在肝脂肪細胞的遷移中發(fā)揮重要作用，在血管生成過程中，miR-27b促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促進血管的新生。本實驗的目的是探討miR-27b在MVSMCs中的功能和發(fā)揮作用的潛在分子機制。
　　方法：
　　細胞培養(yǎng)、MTT分析、熒光素酶報告基因分析、transwell遷移實驗、慢病毒包裝、免疫熒光染色、western blot的實驗方法參見第一章。
　　

15、結論：
　　miR-27b在MVSMCs是一個控制細胞增殖和遷移的因子，被PDGF所調(diào)控，過表達miR-27b對MVSMCs的增殖和遷移有促進的作用，敲低miR-27b對MVSMCs的增殖和遷移有抑制的作用，過表達miR-27b對MVSMCs的凋亡有抑制的作用，敲低miR-27b對MVSMCs的凋亡有促進的作用。對于其作用機制的研究表明，過表達miR-27b下調(diào)MVSMCs標記性基因sma的表達，敲低miR-27b對其表達有上調(diào)的