Drosha基因和mir-15b-16-2在血管平滑肌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 心血管系統(tǒng)疾病是全球人類健康的最大威脅之一，影響心血管系統(tǒng)疾病的因素非常復(fù)雜。miRNA是近年來生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，生命體的許多生理過程（包括疾病的發(fā)生）都與miRNA有關(guān)。因此，深入研究miRNA與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系將有助于人們揭示心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生機(jī)理。miRNA是長度22nt左右的非編碼小RNA，通過與多種靶基因mRNA的3'UTR不完全互補(bǔ)結(jié)合，從而降解靶基因，達(dá)到對(duì)這些基因負(fù)向調(diào)控的目的，調(diào)節(jié)機(jī)體相應(yīng)

2、的生理功能。在miRNA成熟的過程中，有三種關(guān)鍵酶的參與，其中Drosha與DGCR8結(jié)合后，在細(xì)胞核內(nèi)將pri-miRNA加工成為pre-miRNA，然后pre-miRNA在細(xì)胞漿中由Dicer酶加工成為成熟的miRNA。為深入研究miRNA在血管平滑肌細(xì)胞中的功能，本課題制備了Drosha基因在血管平滑肌細(xì)胞中條件性敲除小鼠，并且利用腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)，構(gòu)建體外培養(yǎng)的小鼠血管平滑肌細(xì)胞中Drosha基因敲除和抑制的模型，在體

3、內(nèi)和體外分別驗(yàn)證Drosha基因在血管平滑肌細(xì)胞中缺失后，動(dòng)物整體發(fā)育、血管發(fā)育情況，以及對(duì)血管平滑肌細(xì)胞功能的影響，并且闡述其分子機(jī)制。本課題亦選擇mir-15b/16-2為研究對(duì)象，制備了mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠，并進(jìn)行血壓測定，分離出mir-15b/16-2過表達(dá)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞，并且利用慢病毒技術(shù)，在小鼠血管平滑肌細(xì)胞中抑制mir-16的表達(dá)，進(jìn)行相關(guān)表型和分子機(jī)制研究。
　　 方法：
　　 第一章

4、Drosha基因在血管平滑肌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究血管平滑肌條件性Drosha基因敲除小鼠的制備:通過Droshaloxp/loxp/SM22-Cre×Droshaloxp/+/SM22-Cre或 Droshaloxp/+/SM22-Cre×Droshaloxp/+/SM22-Cre的繁殖模式，獲得Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠，提取尾組織DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測新生小鼠基因型，檢查繁殖母鼠陰道栓，當(dāng)日檢

5、查有陰道栓者為胚胎期E0.5天，取E12.5、E13.5、E14.5和E15.5天的懷孕母鼠，皮下注射氯胺酮和賽拉嗪麻醉后頸椎脫臼處死，70％酒精消毒后，取胚胎卵黃囊，提取基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測基因型以確定Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細(xì)胞中Drosha基因的敲除:分離基因型為Droshaloxp/loxp的成年小鼠血管平滑肌細(xì)胞，經(jīng)過SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染永生化之后，加入表達(dá)C

6、re酶和GFP的腺病毒，感染細(xì)胞24小時(shí)以上，能觀察到GFP綠色熒光者為Cre酶表達(dá)陽性細(xì)胞，體外細(xì)胞水平上敲除Drosha基因。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細(xì)胞中Drosha基因的抑制:利用小鼠血管平滑肌細(xì)胞系和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Drosha基因shRNA，在正常小鼠血管平滑肌細(xì)胞中沉默Drosha基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝:脂質(zhì)體法將pCMV-VSVG和shRNA載體共轉(zhuǎn)染至GD-293細(xì)胞系包裝病毒，轉(zhuǎn)染后60h收集上清，25000g，9

7、0min低溫超速離心法純化病毒。將病毒和polybrene(1 ul/mlDMEM)加入在50％-60％生長密度的細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后加入3ug/ml的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，具有嘌呤霉素抗性者為Drosha基因抑制陽性細(xì)胞。Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管厚度的比較和血管平滑肌細(xì)胞增殖能力的測定:E13.5天和E14.5天的懷孕母鼠，皮下注射氯胺酮和賽拉嗪麻醉后頸椎脫臼處死，70％酒精消毒后，取正常和Droshaloxp/loxp/S

8、M22-Cre敲除型小鼠胚胎，去頭部和尾部，取軀干部固定于10％的福爾馬林，經(jīng)過脫水、透明和浸蠟等步驟，包埋后制成4ul切片，HE染色;另取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管切片，進(jìn)行脫蠟和重新水化，抗原修復(fù)結(jié)束后， PCNA一抗和熒光標(biāo)記二抗孵育后，熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果，拍照并進(jìn)行計(jì)算陽性細(xì)胞比例。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細(xì)胞中Drosha基因的敲除或抑制后細(xì)胞增殖能力的測定:取

9、生長密度70％-90％體外培養(yǎng)正常和Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞，制備蛋白樣品，進(jìn)行PCNA的western blot檢測。Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)水平的測定:取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管切片進(jìn)行SMA免疫熒光染色，比較二者的熒光強(qiáng)度;另取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚

10、胎臍動(dòng)脈血管，制備蛋白樣品，進(jìn)行SMA，SM22和CNN1的westernblot檢測。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細(xì)胞中Drosha基因的敲除或抑制后細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)水平的測定:取生長密度50％-70％體外培養(yǎng)正常和Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞，4％多聚甲醛固定，SMA一抗和熒光標(biāo)記二抗孵育后，熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果，拍照并進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定;并且制備蛋白樣品，進(jìn)行SMA，SM22和CNN1的western blot檢測

11、。 Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達(dá)水平的測定:取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管制備蛋白樣品，進(jìn)行信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-AKT的western blot檢測。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細(xì)胞中Drosha基因的敲除或抑制后細(xì)胞信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達(dá)水平的測定:取生長密度70％-90％體外培養(yǎng)正常和Drosha基因

12、敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞制備蛋白樣品，進(jìn)行信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-AKT的western blot檢測。Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管miRNA表達(dá)譜的測定:利用TRIZOL法提取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動(dòng)脈總RNA，RNeasyMinElute Cleanup Kit進(jìn)一步純化，RNA純度和完整度通過AgilentBioanalyzer檢測。利用Affym

13、etrixGeneChipmiRNA arrays進(jìn)行miRNA微陣列表達(dá)譜測定。取1ug總RNA樣品，利用GenisphereFlashTag HSR kit進(jìn)行polyA加尾，標(biāo)記后的RNA與AffymetrixmiRNA array1.0.Chips雜交，洗脫，在FluidicStation450系統(tǒng)中染色，獲取圖像。數(shù)據(jù)分析選取正常和cKO小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管中變化2倍以上的miRNA。成熟的miRNA序列從miRBase中獲得，

14、選取成熟miRNA序列的2-7個(gè)堿基作為種子區(qū)，小鼠基因組序列中的3'UTR序列由UCSC table browser中獲得，利用TargetScan6.2的PERL碼預(yù)測所選miRNA的種子區(qū)與小鼠基因組3'UTR序列的互補(bǔ)位點(diǎn)。選取3'UTR序列有一個(gè)以上miRNA結(jié)合的基因進(jìn)行功能相關(guān)研究，利用DAVID v6.7程序預(yù)測與靶基因相關(guān)的信號(hào)通路，通過DAVID計(jì)算Gene Ontology categories和KEGG數(shù)據(jù)庫中信

15、號(hào)通路的Fisher exact P value，GO categoteis中P值小于5.00E-07的屬于enriched型的，信號(hào)通路中P值小于1.00E-04有顯著性。Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因CD31表達(dá)水平的測定:取E14.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動(dòng)脈血管進(jìn)行免疫熒光染色，并制備蛋白樣品，進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因CD31的western blot檢測

16、。
　　 第二章Mir-15b/16-2在血管平滑肌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠的制備:4-5周齡的雌性SD大鼠，皮下注射孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)進(jìn)行超數(shù)排卵，與雄性SD大鼠合籠，次日上午檢查雌性大鼠陰道栓，收集單細(xì)胞期胚胎。將mir-15b/16-2過表達(dá)的慢病毒載體注射到單細(xì)胞期胚胎的卵周隙，在KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，當(dāng)發(fā)育到二細(xì)胞期的時(shí)候，移植到假孕雌性SD大鼠輸

17、卵管中，縫合后送入動(dòng)物飼養(yǎng)室。剪取新生大鼠尾組織1-2mm，置于熒光倒置顯微鏡下觀察，GFP表達(dá)陽性者為轉(zhuǎn)基因型大鼠;GFP表達(dá)陰性著為野生型大鼠。轉(zhuǎn)基因大鼠的繁殖模式為:野生型（♂）×轉(zhuǎn)基因型（♀）或轉(zhuǎn)基因型(♂)×野生型（♀）;進(jìn)一步進(jìn)行PCR反應(yīng)驗(yàn)證，有特異性條帶者為轉(zhuǎn)基因型大鼠。Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血壓的測定:皮下包埋法持續(xù)14天給予野生型和mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管緊張素Ⅱ，非侵入式血壓測定儀測定第0

18、天、第1天、第4天、第7天、第10天和第13天血壓，并檢測了相關(guān)指標(biāo)。Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細(xì)胞肥大程度的測定:分離和培養(yǎng)成年野生型和Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞SMA免疫熒光染色和F-actin熒光染色，比較兩種細(xì)胞的面積。Mir-15b/16-2過表達(dá)后血管平滑肌細(xì)胞中MEK1和MEK4基因表達(dá)水平的測定:取生長密度70％-90％野生型和Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌

19、細(xì)胞，制備蛋白樣品，進(jìn)行MEK1和MEK4的western blot檢測。Mir-15b/16-2過表達(dá)后血管平滑肌細(xì)胞中信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-P38表達(dá)水平的測定:取生長密度70％-90％野生型和Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細(xì)胞，制備蛋白樣品，進(jìn)行p-ERK1/2和p-P38的western blot檢測。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細(xì)胞中mir-16的抑制:構(gòu)建anti-mir-16慢病毒載體，結(jié)合輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染2

20、93T細(xì)胞，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48-72h，收集上清，25000rpm，4℃超速低溫離心2h濃縮病毒，重懸于DMEM培養(yǎng)基中，分裝后保存于-80℃超低溫冰箱，將病毒和polybrene(1ul/mlDMEM)加入在50％-60％生長密度的細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后加入3ug/ml的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，具有嘌呤霉素抗性者為mir-16表達(dá)抑制的陽性細(xì)胞。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖能力的測定:取生長密度70％左右體外培養(yǎng)mi

21、r-16抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)行BrdU的免疫熒光染色，并且制備蛋白樣品，進(jìn)行PCNA的western blot檢測。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌細(xì)胞遷移能力的測定:細(xì)胞培養(yǎng)用六孔板中加入對(duì)照組和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h，待細(xì)胞單層生長鋪滿孔面，用200ul無菌槍頭劃過細(xì)胞，用PBS輕輕吹洗去脫落的細(xì)胞碎片，測定劃痕距離。繼續(xù)放入37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，24h后分別測

22、定劃痕距離。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌細(xì)胞中信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-P38表達(dá)水平的測定:取生長密度50％-70％體外培養(yǎng)對(duì)照組和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞，經(jīng)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)后，制備蛋白樣品，進(jìn)行p-ERK1/2和p-P38的western blot檢測。mir-16抑制后對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)水平的測定:取生長密度70％-90％體外培養(yǎng)對(duì)照組和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞，制備蛋白樣

23、品，進(jìn)行SMA，SM22和CNN1的western blot檢測，并且對(duì)對(duì)照組和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行CNN1免疫熒光染色。
　　 結(jié)果：
　　 第一章Drosha基因在血管平滑肌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究血管平滑肌細(xì)胞中Drosha基因敲除后，胚胎臍動(dòng)脈血管中Drosha基因表達(dá)水平降低，小鼠胚胎死亡時(shí)間為E13.5天和E14.5天之間。E13.5天cKO胚胎卵黃囊血管分布比正常胚胎少，E14

24、.5天后則完全消失;E13.5天cKO胚胎表型與正常胚胎差別不大，E14.5天cKO胚胎肝臟嚴(yán)重出血，胚胎死亡。Drosha基因敲除胚胎胸主動(dòng)脈血管厚度均比正常胚胎小。E13.5天Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動(dòng)脈血管PCNA陽性細(xì)胞比例顯著降低，western blot結(jié)果顯示，Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動(dòng)脈血管PCNA表達(dá)水平降低。E13.5天Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動(dòng)脈血管SMA免疫熒光強(qiáng)度顯著降

25、低，western blot結(jié)果顯示，Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動(dòng)脈血管SMA、SM22和CNN1表達(dá)水平均降低。E13.5天Drosha基因敲除胚胎與正常胚胎胸主動(dòng)脈血管western blot結(jié)果顯示，Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動(dòng)脈血管信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達(dá)水平均降低。Western blot結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞比正常小鼠血管平滑肌細(xì)胞PCNA表

26、達(dá)水平降低。體外培養(yǎng)Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞比正常小鼠血管平滑肌細(xì)胞SMA免疫熒光強(qiáng)度顯著降低，western blot檢測結(jié)果顯示，Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞SMA、SM22和CNN1表達(dá)水平降低。體外培養(yǎng)Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞western blot檢測結(jié)果顯示，Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達(dá)水平均降低。

27、利用miRNA array的方法檢測正常和Drosha基因敲除胚胎血管平滑肌細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜，在670個(gè)小鼠miRNA探針中過濾掉低信號(hào)，獲得198個(gè)miRNA的array數(shù)據(jù)，其中104個(gè)在cKO胚胎的臍動(dòng)脈血管中表達(dá)明顯降低，27個(gè)沒有明顯變化，67個(gè)表達(dá)上升。選取46種變化2倍以上（升高或降低）的miRNA，利用DAVID分析其3890種靶基因，獲得19個(gè)顯著的Enriched型的功能類型，其中最顯著的兩個(gè)功能類型是pho

28、sphoprotein(P-value=1.1×10-82)和alternative splicing(P-value=1.9×10-41)。通過分析KEGG信號(hào)通路，獲得變化較大的幾條信號(hào)通路，包括MAPK，WNT, actin-cytoskeleton調(diào)節(jié)通路等。
　　 第二章Mir-15b/16-2在血管平滑肌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究成功獲得mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠，其由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血壓（收縮壓、舒張壓）

29、低于野生型，測得其它相關(guān)指標(biāo)亦符合該趨勢。mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細(xì)胞可表達(dá)GFP綠色熒光，F(xiàn)-actin染色顯示其細(xì)胞面積小于野生型。與野生型相比，Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細(xì)胞MEK1和MEK4免疫熒光強(qiáng)度顯著降低，western blot檢測MEK1和MEK4表達(dá)水平降低。westernblot檢測結(jié)果顯示，與野生型相比，Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細(xì)胞中信號(hào)蛋白p-ERK1/

30、2和p-P38表達(dá)水平均降低。mir-16基因抑制后的小鼠血管平滑肌細(xì)胞中MEK1和MEK4基因表達(dá)水平升高。BrdU熒光染色結(jié)果顯示mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌細(xì)胞BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比例顯著高于正常小鼠血管平滑肌細(xì)胞。mir-16基因抑制后，經(jīng)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠血管平滑肌細(xì)胞中信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-P38表達(dá)水平均升高。mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力與正常組相比顯著增強(qiáng)，與正常組相比，mir

31、-16基因抑制后小鼠血管平滑肌細(xì)胞中CNN1表達(dá)水平升高，而SMA和SM22表達(dá)水平無明顯變化。免疫熒光染色結(jié)果顯示，mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌細(xì)胞CNN1熒光強(qiáng)度顯著升高。
　　 結(jié)論：
　　 第一章Drosha基因在血管平滑肌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究成功制備Drosha基因在血管平滑肌細(xì)胞中條件性敲除小鼠。小鼠血管平滑肌細(xì)胞中敲除Drosha基因后，導(dǎo)致小鼠早期胚胎死亡，肝臟嚴(yán)重出血，血管發(fā)育遲緩，血管平

32、滑肌細(xì)胞增殖能力降低，標(biāo)志基因SMA、SM22和CNN1表達(dá)降低，信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達(dá)降低，血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因CD31表達(dá)降低，說明Drosha基因在血管平滑肌細(xì)胞中行使重要的功能，并且影響到血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。血管平滑肌細(xì)胞中Drosha基因的缺失導(dǎo)致miRNA表達(dá)譜的變化，一些與血管平滑肌功能相關(guān)的miRNA表達(dá)水平降低，引起了多個(gè)與血管平滑肌細(xì)胞生長和功能相關(guān)的信號(hào)通路改變。
　　 第二章Mir-15

33、b/16-2在血管平滑肌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究成功制備mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠，mir-15b/16-2可降低由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠血壓（收縮壓和收縮壓）。M ir-15b/16-2在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)之后，細(xì)胞肥大程度降低，MEK1和MEK4及其下游信號(hào)蛋白p-ERK1/2和p-P38表達(dá)水平降低;mir-16在小鼠平滑肌細(xì)胞中表達(dá)抑制之后，細(xì)胞增殖和遷移能力升高，MEK1和MEK4及其下游信號(hào)蛋白p-ERK1