防治血管性疾病藥物的發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià).pdf

1、新藥的研發(fā)與人類健康息息相關(guān)。當(dāng)前,藥物的研發(fā)模式已從盲目、隨機(jī)和偶然性的開發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)橐运幬锇悬c(diǎn)為導(dǎo)向的定向、針對(duì)性強(qiáng)的研究方式,體現(xiàn)出特異、快速、高效的特點(diǎn)。新藥研發(fā)包括藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與確證、藥物篩選模型的建立與先導(dǎo)化合物的獲得、藥物臨床前研究與臨床藥效評(píng)價(jià)等多個(gè)環(huán)節(jié),這中間均涉及到藥理學(xué)不同方面的內(nèi)容和技術(shù),因而藥理學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了藥物的研發(fā)過(guò)程,藥物發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)離不開藥理學(xué)方法和技術(shù)的提升。
　　 當(dāng)人類進(jìn)入新世紀(jì)后,心腦血管疾

2、病己上升到全球疾病譜的第一位,每年因此而喪生的人數(shù)占到總死亡人數(shù)的三分之一以上。血管的病變,包括血管結(jié)構(gòu)的異常和功能的障礙,是大多數(shù)心腦血管疾病的主要發(fā)病原因之一,這些疾病均歸為血管性疾病。目前臨床上用于防治血管性疾病的藥物種類很多,且多數(shù)被證實(shí)具有良好的治療作用。但這類藥物往往治標(biāo)不治本,需要患者終生用藥；其中有些藥物毒副作用較大,影響長(zhǎng)期用藥的依從性以及臨床療效。另外,一個(gè)非常值得重視的問(wèn)題是,盡管現(xiàn)有的治療手段較以往有了很大的改進(jìn)

3、和提高,但血管性疾病的發(fā)病率卻仍呈逐年增加的趨勢(shì),同時(shí)控制率也未見提高。因而,新型血管性疾病防治藥物的發(fā)現(xiàn)及其藥效評(píng)價(jià)一直是藥物研究的主要方向和目標(biāo)之一。
　　 本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)防治血管性疾病藥物的新靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,并建立相應(yīng)的藥物篩選模型,以期發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物；同時(shí)對(duì)已發(fā)現(xiàn)具有活性的針對(duì)新靶點(diǎn)的候選化合物進(jìn)行動(dòng)物藥效學(xué)評(píng)價(jià),為其今后的臨床試驗(yàn)研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 一、尾加壓素Ⅱ受體拮抗劑的篩選研究

4、
　　 尾加壓素Ⅱ(UⅡ)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),是迄今發(fā)現(xiàn)收縮血管活性最強(qiáng)的物質(zhì)。尾加壓素Ⅱ受體(UTR)是上世紀(jì)末才發(fā)現(xiàn)的一種G蛋白偶聯(lián)受體,廣泛分布于人體各組織器官。研究發(fā)現(xiàn),UⅡ在各種血管性疾病中扮演著極其重要的角色,己成為治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等血管性疾病的重要潛在靶點(diǎn)。本論文對(duì)這一新靶點(diǎn)的功能及其相關(guān)藥物的發(fā)現(xiàn)做了初步的研究。
　　 首先,本研究就UⅡ在血管性疾病中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了評(píng)價(jià)。我們發(fā)現(xiàn)UⅡ可增加

5、血管平滑肌細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)和黏著斑的形成,表明UⅡ可通過(guò)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞骨架的重排來(lái)誘導(dǎo)其表型轉(zhuǎn)化,從而增加其遷移能力,影響血管壁的結(jié)構(gòu)和功能。進(jìn)一步的研究表明,血管平滑肌細(xì)胞受到UⅡ刺激后,其分泌炎性介質(zhì)ICAM-1和VCAM-1明顯增加,iNOS和VEGF的mRNA表達(dá)水平也明顯升高；而內(nèi)皮細(xì)胞受到UⅡ刺激后,其合成與釋放NO的能力則明顯降低。由此可見,UⅡ促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制可能與其增加血管的炎性反應(yīng)有關(guān)。
　

6、　 其次,我們針對(duì)UTR這一新靶點(diǎn)建立了其拮抗劑的篩選模型。本研究采用計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù),以GPCR的立體結(jié)構(gòu)模板同源模建hUTR的三維結(jié)構(gòu)；在此基礎(chǔ)上采用基于受體的虛擬篩選方法將樣品庫(kù)中一萬(wàn)多個(gè)小分子化合物與模擬的hUTR進(jìn)行高通量分子對(duì)接,篩選出與hUTR結(jié)合能力最高的前500個(gè)化合物,為后續(xù)實(shí)際藥物篩選提供保證。與此同時(shí),我們構(gòu)建了高表達(dá)hUTR的HEK293穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,利用時(shí)間分辨熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)在細(xì)胞水平將虛擬篩選出

7、來(lái)的500個(gè)化合物進(jìn)行了實(shí)際的受體-配體結(jié)合篩選實(shí)驗(yàn),初篩發(fā)現(xiàn)了12個(gè)具有一定拮抗UTR活性的化合物,但在復(fù)篩中它們均未表現(xiàn)出受體拮抗活性。綜上所述,我們建立起了一套完整的hUTR受體拮抗劑細(xì)胞高通量篩選模型,這類模型也能推廣應(yīng)用于其他GPCR受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)及相關(guān)的藥物研發(fā),具有很好的研究和應(yīng)用前景。
　　 二、體內(nèi)血管損傷性模型的建立及Rho激酶抑制劑作用的評(píng)價(jià)
　　 在本部分中,我們考察了兩種血管損傷模型中血壓和血管功

8、能的改變的情況,分別是L-NAME誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能損傷模型和維生素D3與尼古丁聯(lián)合誘導(dǎo)血管鈣化兩種模型。結(jié)果表明,長(zhǎng)期給予L—NAME可誘導(dǎo)大鼠形成持續(xù)、穩(wěn)定的高血壓狀態(tài),同時(shí)影響胸主動(dòng)脈的舒縮功能；而血管鈣化模型則對(duì)大鼠血壓和血管功能的影響不大。因此,我們最終選用L-NAME誘導(dǎo)大鼠高血壓模型來(lái)評(píng)價(jià)Rho激酶抑制劑的作用及其機(jī)制。
　　 Rho激酶是Rho的小分子G蛋白的效應(yīng)物,具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性,在高血壓、動(dòng)脈粥樣

9、硬化、肺動(dòng)脈高壓、腦血管痙攣、心肌梗死以及心力衰竭等多種心腦血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因而,Rho激酶已成為當(dāng)前針對(duì)血管性疾病藥物研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本室前期利用Rho激酶抑制劑高通量篩選模型獲得若干具有較好抑制活性的小分子化合物,本研究選擇了其中的黃連堿和DL0805在L-NAME誘導(dǎo)大鼠高血壓模型上進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià),同時(shí)也研究了兩者對(duì)血管結(jié)構(gòu)和功能以及高血壓受累器官心臟、腎臟的影響及其作用機(jī)制。
　　 對(duì)血管的研究

10、結(jié)果表明:1)黃連堿和DL0805對(duì)L-NAME誘導(dǎo)大鼠高血壓模型沒有降壓作用,對(duì)心率的影響較小。2)黃連堿和DL0805能通過(guò)阻滯電壓依賴型Ca2+通道和受體調(diào)控型Ca2+通道來(lái)降低血管對(duì)收縮因子NE、KCl、CaCl2以及PDBu等的反應(yīng)性；但對(duì)血管舒張功能的改善無(wú)作用。3)病理學(xué)研究顯示,黃連堿的高劑量組及DL0805可降低血管中膜層的厚度,提示Rho激酶抑制劑在一定程度上可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和肥厚。4)從血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)

11、果看,黃連堿和DL0805可增加血漿中NO含量,同時(shí)降低ROS的水平,提高SOD活性與GSH水平、降低MDA含量,表明Rho激酶抑制劑可通過(guò)抗氧化應(yīng)激而發(fā)揮保護(hù)靶器官的作用。5)Western blotting結(jié)果顯示,黃連堿和DL0805能明顯逆轉(zhuǎn)RhoA/ROCK的過(guò)表達(dá),并能在不同程度上降低p-eNOS、AMPK和Akt的表達(dá)水平。
　　 對(duì)線粒體研究結(jié)果表明:黃連堿和DL0805均可提高腎臟和心臟線粒體呼吸鏈Ⅰ中的RCR

12、和ADP/O,促進(jìn)線粒體呼吸鏈Ⅰ的3態(tài)與4態(tài)呼吸速率,并可顯著提高大鼠腎臟和心臟線粒體ATP含量以及線粒體中SOD和SDH的活性。
　　 對(duì)腎臟的研究結(jié)果表明:1)病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,黃連堿和DL0805可減小腎小球面積,改善腎臟病理狀況。2)Western blotting結(jié)果顯示,黃連堿和DL0805均能不同程度地下調(diào):RhoA的表達(dá)；也能降低腎臟總ERK表達(dá)水平并顯著增加p-ERK的表達(dá),提示其通過(guò)激活ERK通路來(lái)發(fā)揮保護(hù)

13、腎臟的作用。
　　 綜上,雖然Rho激酶抑制劑黃連堿和DL0805在L-NAME誘導(dǎo)大鼠高血壓模型中未表現(xiàn)出降壓效果,但它們可通過(guò)影響Ca2+通道調(diào)節(jié)血管收縮功能,減少氧化應(yīng)激反應(yīng),下調(diào)RhoA/ROCK的表達(dá)水平,從而逆轉(zhuǎn)血管壁的病理性增生,同時(shí)可改善L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠腎臟、心臟的線粒體功能,并通過(guò)影響RhoA/ROCK及ERK通路而減少腎臟的結(jié)構(gòu)和功能性病變。由此可見,黃連堿和DL0805通過(guò)抑制Rho激酶活性發(fā)揮保

14、護(hù)高血壓受累器官如血管、腎臟、心臟的作用。
　　 三、匹諾塞林對(duì)腦血管疾病的作用研究
　　 缺血性中風(fēng)(即腦缺血)是由于腦血管栓塞導(dǎo)致的大腦供血中斷而引發(fā)一系列病理生理性損傷的疾病,為血管性病變的一種。當(dāng)前的治療藥物除了溶栓藥外,其余幾乎均為神經(jīng)保護(hù)類藥物。本室經(jīng)過(guò)十多年的研究,發(fā)現(xiàn)匹諾塞林具有較好神經(jīng)保護(hù)以及舒張血管的作用。為進(jìn)一步確證其在腦缺血中的療效,我們研究了匹諾塞林在局部腦缺血再灌注大鼠中的治療時(shí)間窗,并評(píng)價(jià)了

15、其在全腦缺血再灌注大鼠模型中的治療作用。
　　 結(jié)果顯示,在大鼠局灶性腦缺血再灌注1h、4 h、6 h后靜脈注射給予匹諾塞林1mg/kg和5 mg/kg,均能改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)癥狀,減小腦梗塞體積,減輕腦水腫程度,其治療時(shí)間窗為6 h。在大鼠全腦缺血再灌注模型中,匹諾塞林可減少腦水腫的發(fā)生,改善缺血后的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn),而形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果也表明匹諾塞林可有效逆轉(zhuǎn)缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡；同時(shí),匹諾塞林還能劑量依賴性地降低大腦MDA水平

16、,下調(diào)因過(guò)度氧化而激活的SOD活性,使其恢復(fù)到正常水平,減少M(fèi)PO激活引起的炎癥反應(yīng),綜合調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸遞質(zhì)的代謝平衡,從而發(fā)揮有效的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 以上結(jié)果表明匹諾塞林是一個(gè)具有抗腦缺血損傷并積極發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的化合物,可能成為防治腦卒中類血管性疾病的新藥物。
　　 本論文對(duì)三個(gè)不同方面的血管性疾病藥物靶點(diǎn)進(jìn)行了研究,并對(duì)該類藥物發(fā)現(xiàn)中靶點(diǎn)確證、模型建立與藥物篩選、活性化合物的藥效評(píng)