氬氦冷凍對腫瘤抑制性樹突狀細胞的影響及聯(lián)合anti-CTLA4單抗抑制膠質(zhì)瘤的試驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腫瘤之一，占顱腦腫瘤的40％～50％，由于膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細胞瘤呈浸潤性生長，廣泛深入正常腦組織，且對放化療均不敏感，手術(shù)創(chuàng)傷及放化療又對機體免疫力產(chǎn)生抑制和破壞，致使其復發(fā)率和死亡率普遍居高不下。
　　CTLA4是表達在活化T細胞和Treg細胞上的抑制性共刺激分子受體，anti CTLA4抗體(ipilimumab)在2011年被美國FDA批準用于晚期有轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者的治療。
　　第一章 氬氦冷

2、凍腫瘤對免疫抑制性樹突狀細胞功能的影響
　　目的:研究氬氦冷凍腫瘤后對于腫瘤引流淋巴結(jié)中的免疫抑制性樹突狀細胞功能的影響。
　　方法:通過建立皮下GL261膠質(zhì)瘤小鼠模型，利用氬氦冷凍治療或普通手術(shù)切除治療，將小鼠分為空白對照組、腫瘤對照組、氬氦冷凍腫瘤組及手術(shù)切除腫瘤組。在給予處理2周后，分離腫瘤引流淋巴結(jié)，流式檢測腫瘤引流淋巴結(jié)中的樹突狀細胞的數(shù)量、表型及白介素10(IL-10)的表達。利用CFSE流式檢測腫瘤引流淋巴結(jié)

3、中的樹突狀細胞刺激T細胞增殖能力。利用T細胞細胞毒試驗檢測T細胞對腫瘤細胞殺傷能力。對處理小鼠再次接種GL261膠質(zhì)瘤細胞，檢測其二次抗腫瘤免疫能力，測量二次接種腫瘤體積，繪制二次腫瘤生長曲線。記錄二次腫瘤小鼠生存期，繪制生存期曲線。免疫熒光檢測二次腫瘤中侵潤樹突狀細胞的表達。再各組小鼠處理后，清除調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)，記錄各組小鼠生存期，繪制生存期曲線。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建皮下GL261膠質(zhì)瘤小鼠模型并實施治療分組。二次腫瘤

4、免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)，手術(shù)切除腫瘤組的二次腫瘤組織中侵潤的樹突狀細胞較多的表達IL-10，而氬氦冷凍腫瘤組的二次腫瘤組織中侵潤的樹突狀細胞則較少的表達IL-10。在清除Treg細胞后，空白對照組小鼠平均生存期為36.6±3.37天，腫瘤對照+清除Treg組小鼠平均生存期為35.2±4.8天，氬氦冷凍腫瘤十清除Treg組小鼠平均生存期為66.6±7.5天，手術(shù)切除腫瘤+清除Treg組小鼠平均生存期為44.6±5.4天。氬氦冷凍腫瘤+清除Tr

5、eg組小鼠生存期顯著優(yōu)于空白對照組，有統(tǒng)計學差異(P=0.011)。
　　結(jié)論:氬氦冷凍小鼠GL261膠質(zhì)瘤可以改變腫瘤引流淋巴結(jié)中的樹突狀細胞的數(shù)量及表型，降低免疫抑制因子IL-10的表達，增強刺激T淋巴細胞的能力，提高效應T細胞對小鼠GL261膠質(zhì)瘤細胞的殺傷能力。可延緩二次接種腫瘤的生長速度，減少二次腫瘤中侵潤表達IL-10的樹突狀細胞，同時予以清除免疫調(diào)節(jié)細胞Treg，可增強抵抗二次腫瘤的能力，延長二次腫瘤生存期。

6、　　第二章氬氦冷凍裂解物聯(lián)合anti-CTLA4抗體原位治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤小鼠的療效分析
　　目的:通過探索氬氦冷凍裂解物聯(lián)合anti-CTLA4抗體原位治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤小鼠，分析其抗腫瘤療效，研究其抗腫瘤機制。
　　方法:建立顱內(nèi)膠質(zhì)瘤小鼠模型，采用顱內(nèi)原位注射氬氦冷凍裂解物及/或anti-CTLA4抗體，分為腫瘤對照組（小鼠右腦尾狀核接種1×105/5μl GL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞，不予任何治療。）、anti-CTLA4治療組

7、（小鼠右腦尾狀核接種1×105/5μlGL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞后第3、6、9、12天原位注射anti-CTLA4抗體各一次，每次10μg。）、氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組（小鼠右腦尾狀核接種1×105/5l GL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞后第3、6天原位注射氬氦冷凍膠質(zhì)瘤裂解物各一次，每次10μg。)、聯(lián)合治療組（小鼠右腦尾狀核接種1×105/5μl GL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞后第3、6、9、12天原位注射anti-CTLA4抗體各一次，每次10μ

8、g;第3、6天原位注射氬氦冷凍膠質(zhì)瘤裂解物各一次，每次10μg。），計算各組生存期，評估各組神經(jīng)毒性反應，分離腦侵潤淋巴細胞，流式檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞變化，計算CD4+、CD8+T細胞與Foxp3+Treg細胞比例，檢測腦侵潤淋巴細胞腫瘤細胞殺傷能力，免疫熒光證實腦侵潤淋巴細胞，提取腦腫瘤組織，檢測腫瘤微環(huán)境中IL-10、IL-12、IL-4及IFN-gama表達情況，給予清除CD4+、CD8+T淋巴細胞后，分析各組小鼠生存

9、期，評價其療效機制。
　　結(jié)果:成功建立腦膠質(zhì)瘤小鼠模型并按照各組實施治療。治療操作可靠，未見因治療手術(shù)操作死亡小鼠。腫瘤對照組、anti-CTLA4治療組、氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組、聯(lián)合治療組小鼠平均生存期為28.8±1.31天、39.9±3.8天、32.7±1.7天、51.9±3.4天，治療組生存期均優(yōu)于腫瘤對照組，(P=0.010，P=0.028，P＜0.001)，anti-CTLA4治療組和氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組生存期無

10、顯著統(tǒng)計學差異(P=0.123)，聯(lián)合治療組生存期優(yōu)于anti-CTLA4治療組及氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組(P-0.046，P=0.001)。神經(jīng)系統(tǒng)評分中，在腫瘤接種第7天，腫瘤對照組評分平均秩次為12.05，聯(lián)合治療組評分平均秩次為8.95，Z=-1.33，P=0.181，兩組差異無統(tǒng)計學意義。在腫瘤接種第13天，腫瘤對照組評分平均秩次為14.2，聯(lián)合治療組評分平均秩次為6.8，Z--2.87，P=0.004，兩組差異有統(tǒng)計學意義，

11、腫瘤對照組評分高于聯(lián)合治療組評分。腫瘤對照組腦組織HE染色，可見腦內(nèi)膠質(zhì)瘤巨大，侵潤正常腦組織，而聯(lián)合治療組腦組織HE染色，可見正常腦組織，未見腫瘤細胞侵潤，可見淋巴細胞侵潤。經(jīng)免疫熒光染色后，腫瘤對照組中有較少腦CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞侵潤。聯(lián)合治療組可見較多的腦侵潤CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞。流式細胞術(shù)檢測腦侵潤淋巴細胞，對于腦侵潤淋巴細胞中CD4+T淋巴細胞的比例，聯(lián)合治療組顯著高于腫瘤對照組(P＜0.0

12、01)、anti-CTLA4治療組(P-0.002)和氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組(P＜0.001);對于腦侵潤淋巴細胞中CD8+T淋巴細胞的比例，聯(lián)合治療組顯著高于腫瘤對照組(P＜0.001)、anti-CTLA4治療組(P＜0.001)和氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組;聯(lián)合治療組中的CD4+、CD8+T淋巴細胞相對數(shù)量計數(shù)分別為0.46±0.048/Million、0.71±0.019/Million，顯著高于其他三組（所有P＜0.001）。

13、同樣，腫瘤對照組與聯(lián)合治療組的脾臟淋巴細胞中CD4+Foxp3-/Foxp3+的比例無顯著統(tǒng)計學差異(P=0.713)，但腦侵潤淋巴細胞中CD4+Foxp3-/Foxp3+的比例，聯(lián)合治療組顯著高于腫瘤對照組(P=0.005);腫瘤對照組與聯(lián)合治療組的脾臟淋巴細胞中CD8+Foxp3-/Foxp3+的比例無顯著統(tǒng)計學差異(P=0.102)，但腦侵潤淋巴細胞中CD8+Foxp3-/Foxp3+的比例，聯(lián)合治療組高于腫瘤對照組7倍(P=0.

14、003)。在腫瘤細胞殺傷實驗中，效應細胞:靶細胞為10、20、40時，聯(lián)合治療組腦侵潤淋巴細胞殺傷效率均高于脾臟淋巴細胞組(P=0.005、P＜0.001、P＜0.001)和腫瘤對照組(P=0.007、P＜0.001、P＜0.001)，在聯(lián)合治療組中，腦侵潤淋巴細胞對于GL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞的殺傷效率均高于B16小鼠黑色素瘤細胞（效靶比-10，P-0.002、效靶比=20，P＜0.001、效靶比=40，P＜0.001）和Hepal-6

15、小鼠肝細胞癌細胞（效靶比=10，P=0.002、效靶比=20，P＜0.001、效靶比=40，P＜0.001）。同時，聯(lián)合治療組腦侵潤淋巴細胞殺傷GL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞釋放的IFN-gama劑量顯著大于正常小鼠脾臟淋巴細胞(P＜0.001)和腫瘤對組腦侵潤淋巴細胞(P＜0.001)的釋放量。在熒光定量PCR檢測腦腫瘤組織細胞因子實驗中，聯(lián)合治療組腦腫瘤組織中IL-10的表達僅為腫瘤對照組的三分之一(P=0.02)，而氬氦冷凍腫瘤裂解物治

16、療組中IL-10的表達為腫瘤對照組的1.6倍(P=0.036)。聯(lián)合治療組腦腫瘤組織中IL-12的表達為腫瘤對照組表達的7.17±1.51倍，有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。聯(lián)合治療組腦腫瘤組織中IL-4的表達為腫瘤對照組表達的0.53±0.24倍，有統(tǒng)計學差異(P=0.024)。聯(lián)合治療組腦腫瘤組織中IFN-gama的表達為腫瘤對照組表達的3.76±0.25倍，有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。在清除CD4+或CD8+淋巴細胞后，聯(lián)合治

17、療小組小鼠與聯(lián)合治療+ CD4 depletion小鼠生存期無顯著差異(P-0.134)，聯(lián)合治療+CD8-depletion小鼠生存期顯著少于聯(lián)合治療組小鼠，有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。
　　結(jié)論:腫瘤原位注射anti-CTLA4抗體聯(lián)合腫瘤凍融裂解物可以治療腦膠質(zhì)瘤小鼠，可以延長小鼠存活時間，改善小鼠生存期，并且具有較小的神經(jīng)系統(tǒng)毒性。聯(lián)合治療可以增加腦侵潤淋巴細胞CD4+、CD8+T淋巴細胞比例及數(shù)量，增加了效應T細胞與