氬氦冷凍治療荷9L膠質(zhì)瘤鼠的療效及其樹突狀細(xì)胞的初步研究.pdf

1、研究背景
　　 膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為常見的惡性腫瘤。雖然現(xiàn)在對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療包括手術(shù)、放療、化療等治療，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然非常差。免疫治療因能夠直接作用于腫瘤細(xì)胞目前成為比較有前景的治療新方法。這種方法能夠維持長期的抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時(shí)沒有任何神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
　　 氬氦冷凍治療技術(shù)是近年源自美國氬氦冷凍治療設(shè)備而興起的一種低溫冷凍技術(shù)。目前，此項(xiàng)治療技術(shù)發(fā)展迅速，因?yàn)樗僮骱唵?，靶向性?qiáng)，適應(yīng)癥廣，加之治療過程中靶區(qū)可以

2、適時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)病人損傷小，消融效果確切。已經(jīng)成為無法外科根治性切除的實(shí)體腫瘤患者治療的最佳手段之一，極大的推動(dòng)了臨床腫瘤治療學(xué)的進(jìn)步，顯著改善了腫瘤患者的治療條件、生存狀況和預(yù)后。隨著近年來氬氦冷凍在全世界范圍內(nèi)的開展，它可對(duì)多種良惡性腫瘤施行精確冷凍治療，尤其在肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎腫瘤、乳腺癌等治療領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用于臨床。資料顯示冷凍治療效果不僅在于超低溫直接殺傷腫瘤細(xì)胞，更重要的是激活機(jī)體抗腫瘤免疫系統(tǒng)。
　　 許多

3、文獻(xiàn)顯示腫瘤通過氬氦刀治療后能夠有效的在體內(nèi)傳遞抗原激活自身免疫系統(tǒng)。樹突狀細(xì)胞是最強(qiáng)的抗原呈遞，它在誘導(dǎo)免疫方面起著至關(guān)重要的作用。目前在體外培養(yǎng)并通過腫瘤抗原致敏的成熟樹突狀細(xì)胞已作為腫瘤疫苗用于臨床。但是，體內(nèi)抗原刺激形成的成熟樹突狀細(xì)胞是最為便利的樹突狀細(xì)胞疫苗。
　　 在顱內(nèi)膠質(zhì)瘤治療中，對(duì)于那些對(duì)化學(xué)治療和放射治療無效或不適宜手術(shù)治療的病人，氬氦冷凍治療為這些患者提供了一個(gè)有效的方法，但這一技術(shù)在顱內(nèi)膠質(zhì)瘤手術(shù)中的應(yīng)

4、用還不夠成熟，臨床上有少量的病例報(bào)道認(rèn)為其對(duì)膠質(zhì)瘤的療效較好，但尚缺乏必要的基礎(chǔ)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本研究擬建立荷9L膠質(zhì)瘤的F344大鼠動(dòng)物模型，并進(jìn)行氬氦冷凍治療，觀察腫瘤細(xì)胞病理以及樹突狀細(xì)胞的免疫變化情況，為其臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 第一章9L/Fischer344大鼠腦膠質(zhì)瘤模型及氬氦冷凍模型的建立及生存期觀察
　　 目的
　　 1.成功建立膠質(zhì)瘤大鼠模型。
　　 2.觀察氬氦冷凍治療荷

5、腦膠質(zhì)瘤鼠前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.空白對(duì)照組、手術(shù)切除組、氬氦冷凍組腫瘤生長情況及生存期觀察。
　　 方法
　　 1.9L腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇;種植9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞于F344大鼠鼠背;荷腦膠質(zhì)瘤F344大鼠模型的建立;膠質(zhì)瘤標(biāo)本制片，腫瘤組織病理學(xué)觀察，GFAP和S-100蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè);動(dòng)物模型的分組（空白對(duì)照組、手術(shù)切除組、氬氦冷凍治療組）。
　　 2.各組膠質(zhì)瘤大鼠的形態(tài)和病理

6、學(xué)變化，觀察荷腦膠質(zhì)瘤大鼠;HE染色，電鏡觀察冷凍消融的腫瘤組織的形態(tài);分別在干預(yù)治療前、術(shù)后游標(biāo)卡尺測(cè)量并計(jì)算、分析比較各組腫瘤的體積變化，以及各組大鼠生存期的觀察。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:Kaplan-Meier生存分析描繪各組模型大鼠生存曲線;腫瘤體積的變化比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。
　　 結(jié)果
　　 1.光鏡下腫瘤細(xì)胞巢狀排列緊密，腫瘤無包膜，瘤周小血管擴(kuò)張，可見腫瘤細(xì)胞沿小血管浸潤生長;瘤內(nèi)新生血管豐

7、富，瘤內(nèi)常見出血、凝固性壞死灶。高倍鏡下，腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，分化程度低，核大、多核，核質(zhì)深染，異型性高。GFAP、S-100染色:腫瘤細(xì)胞未見染色，腫瘤細(xì)胞間膠質(zhì)網(wǎng)可見陽性染色。
　　 2.氬氦冷凍組在冷凍后，HE染色示:冷凍中央?yún)^(qū)呈均勻性凝固性壞死。邊緣區(qū)包括炎性反應(yīng)帶、出血水腫帶(HEB)和邊界帶。炎性反應(yīng)帶主要為一些細(xì)胞碎片及大量的紅、白細(xì)胞浸潤;緊挨炎性反應(yīng)帶的是出血水腫帶:微血管內(nèi)也發(fā)現(xiàn)大量的紅細(xì)胞、血小板集合和血栓形

8、成，并可見灶性出血。電鏡示:冷凍區(qū)中央、邊緣區(qū)組織細(xì)胞全部壞死或凋亡。
　　 3.9L/Fischer344模型腫瘤持續(xù)生長;動(dòng)物模型的分組（空白對(duì)照組、手術(shù)切除組、氬氦冷凍治療組）的大鼠，平均生存時(shí)間分別為78.500±1.061、171.000±10.839、252.778±5.013天。各組模型大鼠平均生存時(shí)間經(jīng)log rank檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=12.403，P=0.002)。
　　 4.接種后第3

9、0天空白對(duì)照組腫瘤體積達(dá)到5.197±0.162 cm3，手術(shù)組達(dá)到5.002±0.175cm3，氬氦冷凍組5.024±0.159 cm3，3組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.107，P=0.899)。干預(yù)后30天組間效應(yīng)之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4648.049，P=0.000)，各個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)時(shí)腫瘤體積變化顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1099.806，P=0.000)，兩者之間具有交互作用(F=1531.868，P=0.001)。

10、>　　 結(jié)論
　　 1.9L/Fischer344大鼠膠質(zhì)瘤模型成功建立。該方法建立的大鼠腦膠質(zhì)瘤模型穩(wěn)定可靠，大鼠腦內(nèi)腫瘤持續(xù)生長，符合惡性膠質(zhì)肉瘤生物學(xué)特性。模型成功率達(dá)100％。
　　 2.該方法簡單、經(jīng)濟(jì)、直視下接種準(zhǔn)確，種植腫瘤細(xì)胞30天，腫瘤體積便可達(dá)5-6cm3，背部便于消融。同時(shí)避免因?yàn)榇笫箫B腔較小，消融后腦水腫造成動(dòng)物死亡。因此，鼠背荷膠質(zhì)瘤是氬氦冷凍治療腦膠質(zhì)瘤的理想動(dòng)物模型。
　　 3.氬

11、氦刀治療后冷凍區(qū)中央?yún)^(qū)、邊緣區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞全部死亡，未發(fā)現(xiàn)存活的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，腫瘤逐漸消退，周圍淋巴細(xì)胞浸潤，其生存期顯著延長，氬氦刀是治療膠質(zhì)瘤有效的方法。
　　 第二章氬氦冷凍治療荷腦膠質(zhì)瘤大鼠的樹突狀細(xì)胞的檢測(cè)
　　 目的
　　 評(píng)定氬氦冷凍治療組并與空白對(duì)照組、手術(shù)切除組比較荷腦膠質(zhì)瘤大鼠的樹突狀細(xì)胞數(shù)目及成熟度的改變。
　　 方法
　　 1.9L腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇;種植9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞于

12、F344大鼠鼠背;荷腦膠質(zhì)瘤F344大鼠模型的建立;動(dòng)物模型的分組（空白對(duì)照組、手術(shù)切除組、氬氦冷凍治療組）。
　　 2.免疫組化檢測(cè)干預(yù)后30天腫瘤組織內(nèi)CD80+、CD83+、CD86+的表達(dá)情況并計(jì)數(shù)。
　　 3.免疫組化檢測(cè)干預(yù)后30天脾臟組織內(nèi)CD80+、CD83+、CD86+的表達(dá)情況并計(jì)數(shù)。
　　 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)干預(yù)后30天引流淋巴結(jié)組織內(nèi)CD80+、CD86+的陽性細(xì)胞的比例。
　　

13、5.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干預(yù)后30天外周血中IL-12、IFN-γ細(xì)胞因子的變化。
　　 6.各組腫瘤、脾臟、淋巴組織、血清中指標(biāo)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析或單因素方差分析。
　　 結(jié)果
　　 1.免疫組化顯示氬氦冷凍治療組腫瘤及脾臟中CD80+、CD83+、CD86+細(xì)胞染色氬氦冷凍組較空白對(duì)照組及手術(shù)組顯著密集(P＜0.05)。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)干預(yù)后30天引流淋巴結(jié)組織內(nèi)CD80+、CD86

14、+的陽性細(xì)胞的比例:氬氦冷凍組＞手術(shù)切除組、空白對(duì)照組(P＜0.05)。但是空白對(duì)照組和手術(shù)組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　 3.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干預(yù)后30天外周血中IL-12、IFN-γ細(xì)胞因子的變化:外周血中IL-12:氬氦冷凍組＞手術(shù)切除組、空白對(duì)照組，比較有顯著差異(P＜0.01)，但手術(shù)切除組和空白對(duì)照組沒有顯著差異(P＞0.05);血清IFN-γ水平:氬氦冷凍組＞手術(shù)切除組、空白對(duì)照組，比較有顯著差異(