氬氦冷凍治療腫瘤對(duì)機(jī)體免疫功能的影響及其臨床意義.pdf

1、腫瘤是目前世界上死亡率最高的疾病之一,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命。然而,70％～80％的患者確診時(shí)已屬晚期,失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)；而手術(shù)治療,術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍高達(dá)50％-70％,總的治愈率不足10％。因而,以滅活腫瘤細(xì)胞、減輕腫瘤負(fù)荷為目的的微創(chuàng)局部消融治療技術(shù)近年來(lái)引起了廣泛的關(guān)注,局部消融治療可以為失去常規(guī)手術(shù)根治性治療機(jī)會(huì)的實(shí)體腫瘤患者提供新的治療選擇。
　　 1998年10月美國(guó)Endocare公司研制成功一種新型超低溫介入冷

2、熱消融氬氦靶向腫瘤治療設(shè)備:Endocare CryocareTM Surgical System(簡(jiǎn)稱(chēng)美國(guó)氬氦刀),它的發(fā)明是冷凍熱治療技術(shù)發(fā)展的最新成就,不但繼承發(fā)展了超低溫治療學(xué)的基礎(chǔ)和臨床研究成果,而且推出了腫瘤微創(chuàng)治療的新概念一氬氦靶向腫瘤治療技術(shù)(Cryocare Targeted Cryoablation Therapy)。廣州南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院1999年在亞洲率先引進(jìn)這項(xiàng)技術(shù),為中晚期腫瘤患者治療帶來(lái)了福音。美國(guó)氬氦刀

3、是目前唯一可進(jìn)行經(jīng)皮冷熱消融治療的先進(jìn)技術(shù)。對(duì)于不能常規(guī)手術(shù)根治性切除腫瘤病人的治療,應(yīng)該首先選擇微創(chuàng)消融治療,微創(chuàng)消融快速減輕腫瘤負(fù)荷,對(duì)于減輕病人痛苦,提高生存質(zhì)量,保證綜合治療療效具有放化療所不能代替的地位。在微創(chuàng)消融治療技術(shù)當(dāng)中,氬氦刀冷凍治療創(chuàng)傷小,療效好,有效率可以達(dá)到90％以上,已成為許多臨床醫(yī)生術(shù)中治療不可缺少的手段之一。
　　 由于氬氦刀靶向消融治療不需要?jiǎng)兂鋬龊蟮哪[瘤組織,手術(shù)操作簡(jiǎn)便,患者術(shù)后并發(fā)癥少,多

4、數(shù)不影響其它治療措施的選擇。氬氦刀聯(lián)合放療、光動(dòng)力治療、中藥治療均可提高治療效果。同時(shí),實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí),冷凍治療腫瘤可增強(qiáng)機(jī)體的免疫水平,有助于降低腫瘤的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率。氬氦刀治療有抗腫瘤免疫作用:主要是通過(guò)腫瘤細(xì)胞壞死,使腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制分子減少,凍融壞死的原位腫瘤細(xì)胞可成為腫瘤抗原,而達(dá)到增強(qiáng)免疫的效果。1967年Yantomo等和1968年Shulman等首先證實(shí)冷凍免疫反應(yīng)的存在,為冷凍免疫學(xué)奠定了基礎(chǔ)。他們推測(cè)在冷凍

5、治療后,由于機(jī)體清除被摧毀的腫瘤組織,吞噬細(xì)胞遞呈抗原產(chǎn)生針對(duì)殘余腫瘤的抗體,包括產(chǎn)生針對(duì)腫瘤特異性膜表面蛋白的抗體,這些抗體結(jié)合到其他活的腫瘤細(xì)胞的膜表面蛋白上,引發(fā)補(bǔ)體固定和巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的趨化作用,導(dǎo)致宿主的免疫系統(tǒng)被激活,使得剩余的腫瘤組織及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤變小,這種反應(yīng)被稱(chēng)之為冷凍免疫學(xué)效應(yīng)。國(guó)內(nèi)張國(guó)強(qiáng)等分別檢測(cè)10例肺癌患者術(shù)前、后不同時(shí)期的外周血T淋巴細(xì)胞亞群及血清免疫球蛋白的改變,結(jié)果表明:冷凍術(shù)后CD3+T、CD4+T

6、、CD4+T/CD8+T比值較術(shù)前顯著增加,而CD8+T則顯著減少,免疫球蛋白也顯著增加。彭秋平等于肝癌患者中也觀察到了CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T類(lèi)似變化,但CD8+T細(xì)胞較術(shù)前則無(wú)明顯變化。段蘊(yùn)鈾等則發(fā)現(xiàn):氬氦刀冷凍處理的肺癌細(xì)胞可以致敏樹(shù)突狀細(xì)胞,當(dāng)聯(lián)合IL-2時(shí),可提高NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性。目前關(guān)于氬氦冷凍對(duì)免疫功能的影響缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究,要想闡明冷凍免疫的機(jī)制,也需要對(duì)更多的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)

7、。臨床上對(duì)于氬氦冷凍治療腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)認(rèn)識(shí)不清,對(duì)氬氦冷凍治療后是否需要協(xié)同免疫治療亦未有明確認(rèn)識(shí)。因此,有必要對(duì)氬氦冷凍的免疫學(xué)效應(yīng)從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)到臨床應(yīng)用方面做進(jìn)一步研究。
　　 本研究采用SD大鼠皮下移植瘤模型進(jìn)行氬氦冷凍實(shí)驗(yàn),探討氬氦冷凍后大鼠局部和機(jī)體免疫功能的變化。觀察氬氦冷凍后局部組織冷凍消融規(guī)律并對(duì)冷凍周?chē)庖邭麉^(qū)的存在進(jìn)行了證實(shí),通過(guò)檢測(cè)氬氦冷凍后大鼠外周血T細(xì)胞亞群、sIL-2R含量及單個(gè)核細(xì)胞的殺傷能力,對(duì)

8、氬氦冷凍對(duì)大鼠免疫功能的影響進(jìn)行了深入的探討。同時(shí),通過(guò)檢測(cè)76例病人氬氦冷凍前后外周血T細(xì)胞和NK 細(xì)胞水平高低,探討了氬氦冷凍聯(lián)合中藥治療腫瘤的臨床療效及其臨床意義。
　　 本研究共分為3部分:
　　 第一章 SD大鼠皮下移植瘤模型的建立
　　 目的
　　 建立SD大鼠W256細(xì)胞皮下移植瘤模型,為氬氦冷凍治療腫瘤提供一個(gè)理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 方法
　　 w256細(xì)胞凍融后傳代,

9、調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于大鼠腹腔,建立大鼠的腹水模型。以濃縮的腹水接種于大鼠右后腿皮下,建立大鼠的皮下移植瘤模型。定期測(cè)量腫瘤大小。于接種兩周后切取長(zhǎng)勢(shì)良好腫瘤2個(gè),并于試驗(yàn)結(jié)束后切取所有腫瘤,行HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。
　　 結(jié)果
　　 所有接種SD大鼠全部接種成功,生長(zhǎng)良好,腫瘤周?chē)鸁o(wú)感染病灶。腫瘤接種第4天起可扣及皮下小結(jié)節(jié),到接種第3周左右腫瘤平均體積已經(jīng)達(dá)到了3.5cm3,最大腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到5.5cm。2周后切取的

10、腫瘤結(jié)節(jié)大體觀察和HE染色,病理觀察腫瘤為多個(gè)灰白色結(jié)節(jié),質(zhì)軟,光學(xué)顯微鏡下癌細(xì)胞排列密集,細(xì)胞間無(wú)間質(zhì),瘤細(xì)胞呈團(tuán)狀或片狀排列,核大,核仁明顯,核分裂相多見(jiàn),腫瘤內(nèi)可見(jiàn)豐富的小血管。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腫瘤內(nèi)均見(jiàn)不同程度片狀壞死。
　　 結(jié)論
　　 采用濃縮腹水注射法制作SD大鼠w256皮下移植瘤模型,該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),直視下接種部位準(zhǔn)確,成瘤率高,種植2.3周,腫瘤體積可至3.5cm3,利于微創(chuàng)靶向消融技術(shù)的實(shí)施,可為后期采用

11、氬氦冷凍治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)提供理想的動(dòng)物模型。
　　 第二部分 SD大鼠皮下移植瘤氬氦冷凍治療前后免疫功能的變化
　　 目的
　　 觀察氬氦刀冷凍消融治療對(duì)SD大鼠皮下移植瘤組織壞死和細(xì)胞凋亡的影響以及冷凍前后其免疫功能的變化情況,以進(jìn)一步探討氬氦刀冷凍消融治療腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng),為臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。
　　 方法
　　 1.將B組40只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成4組,分別為:荷瘤對(duì)照組,冷凍治療組,手術(shù)治

12、療組,空白對(duì)照組(n=10),麻醉后分別處理。冷凍治療組:氬氦冷凍皮下移植瘤,時(shí)間3～5min,復(fù)溫時(shí)間30s。手術(shù)治療組:將腫瘤盡量全部剝離后,創(chuàng)口清潔縫合。荷瘤對(duì)照組:將氬氦刀置入腫瘤3分鐘,而不予冷凍治療。正常對(duì)照組:只切開(kāi)皮膚,然后清潔縫合。各組SD大鼠均在治療前1天、治療后第1、3、5周眼眶采血1.5ml,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)行T細(xì)胞亞群(CD3+T、CD4+T、CD8+T)、雙抗體夾心法測(cè)血清sIL-2R的含量。
　　 2

13、.將A組36只大鼠隨機(jī)分為兩組,即氬氦冷凍組和荷瘤對(duì)照組(n=18)。分別于冷凍后3,12,24 h和3d,,7d時(shí)處死動(dòng)物,取材。每組各時(shí)間點(diǎn)各處死小鼠3只,盡量完整剝離腫瘤組織。剝離的腫瘤組織貯存于10％福爾馬林溶液中,用于組織病理學(xué)學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。
　　 結(jié)論
　　 1、氬氦刀冷凍治療不但有冷凍消融區(qū)還存在周?chē)拿庖邭麉^(qū),氬氦刀可通過(guò)壞死和凋亡兩種途徑達(dá)到有效的消融。氬氦冷凍治療腫瘤要注意盡量把

14、腫瘤包裹于冰球內(nèi),部分不規(guī)則的腫瘤可能因?yàn)槔鋬鱿诘牟煌耆鴱?fù)發(fā),因此冷凍治療有必要與放化療、免疫治療以及其它的腫瘤治療手段相結(jié)合。
　　 2、氬氦冷凍可有效的啟動(dòng)機(jī)體的免疫效應(yīng)。冷凍后科刺激腫瘤相關(guān)抗原的持續(xù)釋放,具有對(duì)腫瘤相關(guān)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活、增殖作用,可有效誘發(fā)、增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫；并且可增強(qiáng)外周血單個(gè)核細(xì)胞的殺傷能力。
　　 3、氬氦冷凍對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫增強(qiáng)作用可能是有一定限度的,如何促進(jìn)和維持氬

15、氦冷凍的免疫調(diào)節(jié)作用將是一個(gè)值得進(jìn)一步探討的問(wèn)題。
　　 第三部分 氬氦冷凍聯(lián)合中藥治療腫瘤對(duì)機(jī)體免疫功能的影響及其臨床意義的研究
　　 目的
　　 采用氬氦刀聯(lián)合中藥治療76例中晚期腫瘤的患者,以進(jìn)一步研究氬氦冷凍治療腫瘤對(duì)機(jī)體免疫功能的影響,并觀察氬氦冷凍聯(lián)合中藥治療的臨床療效,探討氬氦冷凍聯(lián)合中藥治療腫瘤機(jī)體免疫功能變化的臨床意義。
　　 方法
　　 1.76例腫瘤患者均經(jīng)病理論斷為Ⅲ期或Ⅳ

16、期的晚期惡性腫瘤,隨機(jī)分為2組,即氬氦冷凍治療組和氬氦冷凍聯(lián)合中藥治療組,每組38例。
　　 2.各組患者分別于治療前及治療后2周、4周空腹抽取肘靜脈血經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+T、CD4+T、CD8+T)分布和CD4+T/CD8+T比值,并檢測(cè)NK細(xì)胞水平。
　　 結(jié)果76例患者氬氦冷凍治療后CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T、NK細(xì)胞水平明顯高于治療前,其差異有顯著意義(P=0.000)。氬

17、氦冷凍聯(lián)合中藥治療組在治療2周后CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T、NK細(xì)胞水平略高于單純氬氦冷凍組,但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在治療4周后CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T、NK細(xì)胞水平明顯高于單純氬氦冷凍組(P=0.000),其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 氬氦冷凍治療可刺激機(jī)體免疫能力的提高,有利于解除晚期腫瘤患者的免疫抑制,提高患者的免疫水平。冷凍后聯(lián)合應(yīng)用驅(qū)邪扶正中藥