海蛇蛇毒抗炎活性肽Hydrostatin--SN10的靶點專一性及其結構生物學研究.pdf

1、研究背景:
　　海蛇中富含具有藥用價值的抗炎活性分子，其作用機理和作用靶點尚不明晰。青環(huán)海蛇（Hydrophis cyanocinctus）是分布于中國東南沿海的一種優(yōu)勢蛇種，自古以來就在中國被用作食材和藥材，也是被收錄入《本草綱目》的17種蛇中的其中一種，其蛇毒毒素中含有許多生物活性蛋白質和多肽，在緩解類風濕關節(jié)炎、關節(jié)痹痛和自身免疫性炎癥疾病中有著良好的功效。由于蛇毒中抗炎活性組分的理化性質比較接近，且有些成分豐度很低，通過傳

2、統(tǒng)的色譜技術難以分離獲得單一組分的蛇毒來進行結構、功能和機制方面的研究。本課題組前期利用噬菌體展示文庫技術，建立了以人腫瘤壞死因子Ⅰ型受體(TNFR1)為靶點淘選海蛇蛇毒抗炎活性成分的方法，獲得了22氨基酸的抗炎活性肽Hydrostatin-SN1，通過同源建模、肽鏈截短并利用細胞模型及LPS誘導的小鼠急性休克模型篩選截短肽，得到了靶點特異性更強的十肽Hydrostatin-SN10。在膠原誘導關節(jié)炎(CIA)動物模型和炎癥性腸病(IB

3、D)動物模型中，Hydrostatin-SN10都具有顯著的抗炎效應，有望研發(fā)成為治療TNF-α受體(TNFRs)相關炎癥性疾病的新型靶向特異性海洋多肽類藥物。
　　TNF-α與兩型TNF受體（TNFR1和TNFR2）的相互作用及下游信號通路的異常激活是類風濕關節(jié)炎、潰瘍性結腸炎等自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。先導肽Hydrostatin-SN1與TNFR1、TNFR2均有一定的結合能力，并能拮抗TNF-α與TNFR1/TNF

4、R2的相互作用，而Hydrostatin-SN10與TNFR1的親和力更強，且在細胞水平實驗中能夠在一定濃度范圍內抑制TNFR1介導的下游NF-κB及MAPKs信號通路。但Hydro statin-SN10的靶點專一選擇性尚無明確驗證，即是否與TNFR2結合、能否競爭性抑制TNF-α與TNFRs的相互作用尚沒有進行驗證。同時，TNFR1與Hydrostatin-SN10的結合部位、結合模式和相互作用氨基酸亦不明確。因此，驗證Hydros

5、tatin-SN10的受體選擇性，并探究Hydrostatin-SN1/SN10同TNFR1結合的復合物構象，將為闡明Hydrostatin-SN10特異性拮抗TNFR1發(fā)揮抗炎作用的分子機制打下重要的基礎。
　　研究目的:
　　確證Hydrostatin-SN10對靶點TNFR1拮抗作用的專一性，利用結構生物學的方法測定TNFR1-SN10復合物的三維結構，找到多肽與受體的結合位點和關鍵作用氨基酸，進一步揭示Hydrost

6、atin-SN10選擇性拮抗TNFR1的分子機制，為多肽的結構改造以及新型TNFR1選擇性抑制劑的研發(fā)奠定生物學基礎。
　　研究方法:
　　1、利用多種生物分子相互作用測定技術檢測Hydrostatin-SN10分別與TNFR1、TNFR2和TNF-α的相互作用，獲得親和力常數(shù)、結合動力學參數(shù)和熱動力學參數(shù)等數(shù)據(jù)，分析結合方式與性質，并以競爭性結合的方法觀察Hydrostatin-SN10是否可以阻斷或抑制TNF-α與TNF

7、R1/TNFR2的相互作用。
　　2、通過不依賴連接酶的克隆(Ligation-Independent Cloning,LIC)構建人TNFR1胞外區(qū)(sTNFR1)蛋白的原核表達載體，在大腸桿菌中表達sTNFR1，摸索合適的誘導表達條件;經(jīng)過親和層析、離子交換層析和分子篩層析對目的蛋白進行精細純化，獲得高純度的sTNFR1蛋白。
　　3、等溫滴定量熱法(ITC)鑒定體外表達的sTNFR1與TNF-α結合的生物學活性;微量差

8、示掃描熒光技術(nanoDSF)篩選目的蛋白穩(wěn)定性最高的緩沖液條件。
　　4、將sTNFR1與多肽Hydrostatin-SN1/SN10共孵育，采用懸滴法進行sTNFR1-SN10復合物共結晶和sTNFR1單晶生長的大規(guī)模條件初篩，對部分較好的結晶條件進行優(yōu)化，培養(yǎng)高質量的蛋白晶體。
　　5、使用同位素標記的氮源和碳源在M9培養(yǎng)基中表達和純化15N、13C標記的sTNFR1蛋白;構建麥芽糖結合蛋白(MBP)和Hydro s

9、tatin-SN10的融合表達載體，表達純化15N、13C標記的重組多肽Hydrostatin-SN10。
　　6、運用核磁共振技術(NMR)分別測定15N-sTNFR1和15N-SN10的2D1H-15N HSQC波譜，然后加入相應的未標記配體進行二維滴定，分析化學位移情況，驗證sTNFR1與Hydrostatin-SN10結合的熱點區(qū)域(hot spots)氨基酸;將15N、13C雙標記的蛋白和多肽孵育，收集NMR波譜數(shù)據(jù)，解

10、析復合物的溶液三維結構。
　　研究結果:
　　1、利用表面等離子共振(SPR)、微量熱泳動(MST)、和等溫滴定量熱法(ITC)驗證Hydrostatin-SN10的靶點專一性。SPR實驗表明，Hydrostatin-SN10能特異性結合TNFR1，而和TNFR2、TNF-α沒有特異性結合;Hydrostatin-SN10能夠競爭性抑制TNF-α與TNFR1的相互作用，而對TNF-α與TNFR2的結合沒有影響。MST結果顯示

11、，Hydrostatin-SN10與TNFR1有特異性結合，親和力KD值（平衡解離常數(shù)）為2.83μM;Hydrostatin-SN10與TNFR2和TNF-α沒有相互作用。ITC結果表明，Hydrostatin-SN10與TNFR1存在相互作用，親和力約為2.29μM，與TNFR2、TNF-α沒有結合。
　　2、成功構建人TNFR1胞外區(qū)蛋白的原核表達載體pMCSG7-sTNFR1-161、pMCSG7-sTNFR1-190、p

12、MCSG7-sumo-sTNFR1-161和pMCSG7-sumo-sTNFR1-190。使用LB培養(yǎng)基在大腸桿菌BL21中表達，優(yōu)化了誘導表達溫度、誘導時間和誘導劑濃度。確立了目的蛋白的變性、復性緩沖液體系，通過鎳柱親和層析、陽離子交換層析和凝膠過濾層析分離純化獲得了高純度(＞97％)的sTNFR1蛋白，其產(chǎn)量約為7.3mg每升菌液。
　　3、ITC驗證結果表明，體外表達的重組sTNFR1-161、sTNFR1-190蛋白與TN

13、F-α有良好的結合能力，KD值分別為154.8nM和190.1nM，與文獻報道水平數(shù)量級一致。
　　4、nanoDSF確定了目的蛋白用于結晶實驗的緩沖液條件:20mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，在這個溶液中sTNFR1的Tm值為77.67±0.05℃。使用96孔懸滴板進行結晶條件初步篩選，找到了sTNFR1和TNFR1-SN10復合物的多個結晶條件，對生長較好的條件進行優(yōu)化，獲得了sTNFR1蛋白的高質量

14、晶體(0.2mm×0.2mm×0.1mm)。目前TNFR1-SN10復合物的晶體正在繼續(xù)優(yōu)化中。
　　5、收集sTNFR1晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)，通過分子置換法解析數(shù)據(jù)，得到sTNFR1的高分辨率(1.69(A))三維結構，與已報道的TNFR1胞外區(qū)晶體結構(PDB編號:1NCF)進行疊合比對后顯示二者構象基本一致。
　　6、使用M9培養(yǎng)基和15N-NH4Cl、13C-葡萄糖對sTNFR1進行同位素標記并成功表達純化出了15N

15、-13C-sTNFR1蛋白（純度＞98％）;構建了MBP-多肽的融合表達載體pMCSG9-SN10，體外表達純化得到了15N、13C標記的重組多肽SN10，用于NMR實驗。
　　研究結論:
　　本研究一方面證明了青環(huán)海蛇蛇毒多肽Hydrostatin-SN10能夠專一性結合TNFR1，不與TNFR2或TNF-α結合，并且SN10能夠選擇性地阻礙TNF-α與TNFR1的相互作用;另一方面獲得了多肽SN10與TNFR1復合物的初