酶響應(yīng)的肽類樹狀大分子納米藥物遞送系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、化療藥物在使用過程中普遍存在選擇性差而導(dǎo)致的免疫抑制、骨髓抑制、肝腎損傷等毒副作用，同時存在溶解性差、被快速清除等缺點。實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR effect)可以實現(xiàn)尺寸在10-1000 nm的藥物遞送材料被動靶向至腫瘤部位。肽類樹狀大分子可以通過共價連接、內(nèi)部空隙裝載等手段遞送藥物，聚乙二醇(PEG)修飾的肽類樹狀大分子可以實現(xiàn)納米尺度的自組裝。此外，PEG修飾可以延長血藥循環(huán)時間、增強EPR效應(yīng)、賦予其親水性，降低遞送材

2、料毒性等，但不利于遞送材料的入胞?；谒碾母拾彼幔奖彼幔涟彼幔拾彼?GFLG)的組織蛋白酶B(CB)響應(yīng)可以實現(xiàn)藥物細胞內(nèi)的靶向釋放，基于六肽脯胺酸－纈氨酸－甘氨酸－亮氨酸－異亮氨酸－甘氨酸(PVGLIG)的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)響應(yīng)可以實現(xiàn)遞送材料的去PEG化。
　　為了解決化療藥物在使用過程中普遍存在毒副作用、溶解性差、被快速清除等缺點，設(shè)計了一類酶響應(yīng)的肽類樹狀大分子藥物遞送系統(tǒng)：以肽類樹狀大分子為核心，通

3、過PEG修飾和GFLG共價連接抗腫瘤藥物賦予親疏水性，推動納米尺度的自組裝，通過EPR效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤部位的富集，被腫瘤細胞攝入后，GFLG被CB降解，實現(xiàn)藥物的胞內(nèi)精準(zhǔn)釋放。此外，為了解決PEG不利于入胞，設(shè)計了用MMP-2響應(yīng)的PVGLIG連接PEG和樹狀大分子，當(dāng)遞送材料通過EPR效應(yīng)在腫瘤部位富集后， PVGLIG被MMP-2降解，實現(xiàn)去PEG化，使遞送材料更好的入胞，從而達到提高治療效果的作用。
　　方法:
　　1.組

4、織蛋白酶B響應(yīng)肽類樹狀大分子納米藥物遞送系統(tǒng)
　　1) N3-GFLG-GEM合成。Boc-Gly-OH和H-Phe-OMe·HCl發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，得到 Boc-GF-OMe，并在堿性條件下脫羧基保護得到Boc-GF-OH；Boc-Leu-OH和H-Gly-OMe·HCl發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，得到 Boc-LG-OMe，并在三氟乙酸作用下脫氨基保護，得到 H-LG-OMe；Boc-GF-OH和H-LG-OMe發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，得到B

5、oc-GFLG-OMe，并脫氨基保護，得到H-GFLG-OMe；H-GFLG-OMe與對疊氮苯甲酸反應(yīng)，得到N3-GFLG-OMe；脫羧基保護，得到N3-GFLG-OH，與GEM·HCl（吉西他濱鹽酸鹽）反應(yīng)得到N3-GFLG-GEM。
　　2) Boc-G3(Lys-Glu)-OMe合成。Boc-Lys(Boc)-OH和三(2-氨乙基)胺反應(yīng)，得到 Boc-G1(Lys)；脫氨基保護，再與Boc-Lys(Boc)-OH反應(yīng)，得到

6、 Boc-G2(Lys)；脫氨基保護，再與 Boc-Glu(OMe)-OH反應(yīng)，得到Boc-G3(Lys-Glu)-OMe。
　　3) PEG-G3(Lys-Glu)-Boc合成。Boc-G3(Lys-Glu)-OMe脫羧基保護，再與炔丙胺反應(yīng)，得到Boc-G3(Lys-Glu)-Alkyne；Boc-G3(Lys-Glu)-Alkyne與 N3-PEG通過 Cu+催化的點擊反應(yīng)得到PEG-G3(Lys-Glu)-Boc。

7、　　4) PEG-G3-GFLG-GEM合成。PEG-G3(Lys-Glu)-Boc脫氨基保護，再與己炔酸反應(yīng)，得到PEG-G3(Lys-Glu)-Alkyne；PEG-G3(Lys-Glu)-Alkyne與N3-GFLG-GEM通過Cu+催化的點擊反應(yīng)得到PEG-G3-GFLG-GEM。
　　5) PEG-G3-GFLG-GEM共載DOX。稱取PEG-G3-GFLG-GEM和去鹽酸阿霉素用DMSO溶解；將2 ml去離子水加入編號

8、為Group1至6的10 ml離心管中，在超聲探頭超聲條件下滴加DMSO溶液，使PEG-G3-GFLG-GEM:DOX質(zhì)量比分別為2:0、2:0.2、2:0.5、2:1、2:2、2:4，搖床孵育12 h，5000rpm離心5 min，從上清液取1.8 ml凍干，用1.8 ml去離子水復(fù)溶。
　　6)共載納米材料制備及表征。按照PEG-G3-GFLG-GEM:DOX（阿霉素）質(zhì)量比為1:1、方法同前制備共載納米材料。用粒度電位儀測量

9、粒徑和Zeta電位，用透射電子顯微鏡（TEM）進行形態(tài)表征。
　　7)載藥量測定。配制不同濃度的 GEM·HCl和DOX·HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外-可見分光光度計分別在270nm和480nm測量吸光度。稱取PEG-G3-GFLG-GEM和共載納米材料，配成濃度1mg/ml溶液，分別稀釋3倍和5倍測吸光度。
　　8)藥物釋放。將納米共載材料用pH=5.4緩沖液溶解加入到透析膜中，放入緩沖液，37℃孵育。在不同時間點取樣。設(shè)置不含

10、木瓜蛋白酶和 pH=7.4的對照組。使用高效液相色譜(HPLC)測量取樣濃度。
　　9)細胞毒性試驗。將4T1細胞加入不同濃度的藥物和納米共載材料，用CCK-8試劑盒和酶標(biāo)儀測定細胞活性。
　　2.基質(zhì)金屬蛋白酶-2和組織蛋白酶 B雙重酶響應(yīng)的肽類樹狀大分子納米藥物遞送系統(tǒng)
　　1) PEG-PVGLIG-Alkyne合成。Boc-Pro-OH和H-Val-OMe·HCl發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，得到Boc-PV-OMe，脫羧

11、基保護，再與 H-Gly-OMe·HCl反應(yīng)得到 Boc-PVG-OMe；Boc-Leu-OH和 H-Ile-OMe·HCl發(fā)生脫水縮合反應(yīng)得到 Boc-LI-OMe，脫羧基保護再與 H-Gly-OMe·HCl反應(yīng)，得到Boc-LIG-OMe。Boc-PVG-OMe和Boc-LIG-OMe分別脫羧基保護和氨基保護后，發(fā)生脫水縮合反應(yīng)得到Boc-PVGLIG-OMe。Boc-PVGLIG-OMe脫羧基保護，與炔丙胺反應(yīng)，得到Boc-PVG

12、LIG-Alkyne。Boc-PVGLIG-Alkyne脫氨基保護，與mPEG-SC反應(yīng)，得到PEG-PVGLIG-Alkyne。
　　2) PEG-PVGLIG-G3-OMe合成。Boc-G3(Lys-Glu)-OMe脫氨基保護，與疊氮苯甲酸反應(yīng)，得到N3-G3(Lys-Glu)-OMe，與PEG-PVGLIG-Alkyne通過Cu+催化的點擊反應(yīng)得到PEG-PVGLIG-G3-OMe。
　　3) N3-GFLG-DOX合

13、成。將前一部分得到的N3-GFLG-OH與DOX·HCl反應(yīng)得到N3-GFLG-DOX。
　　4) PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX合成。PEG-PVGLIG-G3-OMe脫羧基保護，與炔丙胺反應(yīng)，得到PEG-PVGLIG-G3-Alkyne，與N3-GFLG-DOX通過Cu+催化的點擊反應(yīng)得到PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX。
　　5)自組裝及納米材料表征。配制PEG-PVGLIG-G3-GFLG-

14、DOX水溶液，粒度電位儀測量粒徑和Zeta電位。
　　6)載藥量測定。配制不同濃度的DOX·HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外-可見分光光度計在480nm測量吸光度。配制濃度為1mg/ml的PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX溶液，稀釋6倍測吸光度。
　　結(jié)果：
　　1.組織蛋白酶B響應(yīng)肽類樹狀大分子納米藥物遞送系統(tǒng)
　　1)通過ESI+、MALDI-TOF-MS和1H NMR等手段對合成產(chǎn)物的分子量和氫譜進行表征，

15、圖譜結(jié)果顯示，PEG-G3-GFLG-GEM被成功合成。
　　2)不含有DOX時，體系成負(fù)電荷性質(zhì)，加入DOX后，Zeta電位變?yōu)檎?，而且隨著DOX的增加，Zeta電位隨之升高之后保持穩(wěn)定。
　　3) PEG-G3-GFLG-GEM自身體系粒徑為10nm左右，共載DOX后，粒徑分布在100-300之間。
　　4) DOX載藥量隨著DOX總量的增加而增加。
　　5)按1:1質(zhì)量比制備的納米共載材料粒徑為290 n

16、m、PDI為0.187，GEM載藥量為6.07％，DOX載藥量為11.5%。
　　6)釋放結(jié)果顯示GEM在無酶條件下沒有釋放，在酶存在條件下，pH5.4組釋放（20%）大于pH7.4釋放（13%）。DOX的釋放pH5.4+酶（65%）>pH5.4（50%）>pH7.4+酶（30%）≈pH7.4（30%）
　　7)共載材料組 IC50=0.0545 ug/ml,是 PEG-G3-GFLG-GEM組(IC50=0.101 ug/

17、ml)的一半，是GEM·HCl組(IC50=0.226 ug/ml)的四分之一。
　　2.基質(zhì)金屬蛋白酶-2和組織蛋白酶 B雙重酶響應(yīng)的肽類樹狀大分子納米藥物遞送系統(tǒng)
　　1)通過ESI+、MALDI-TOF-MS和1H NMR等手段對合成產(chǎn)物的分子量和氫譜進行表征，圖譜結(jié)果顯示，PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX被成功合成。
　　2) PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX溶液體系粒徑為128nm，Z

18、eta電位為-6.39mV。
　　3) DOX載藥量為9.24%。
　　結(jié)論：
　　1.成功合成 GFLG四肽、三代肽類樹狀大分子 G3(Lys-Glu)及具有酶響應(yīng)性的PEG-G3-GFLG-GEM；PEG-G3-GFLG-GEM可以共載DOX（阿霉素）自組裝，形成具有組織蛋白酶B響應(yīng)性的共載納米材料。體外實驗表明，該共載材料具有良好的抗腫瘤效果。
　　2.成功合成 PVGLIG六肽及 PEG-PVGLIG-G