生物活性肽的大分子修飾及活性研究.pdf

1、生物活性肽類藥物以具有高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)倍受青睞，但因其體內(nèi)穩(wěn)定性差、作用時(shí)間短而限制了其臨床應(yīng)用。多肽類激素降鈣素（Calcitonin，CT），含有32個(gè)氨基酸殘基，從不同種屬動(dòng)物中分離得到的天然降鈣素，雖然它們的氨基酸殘基有所差別，但是分子中都有一個(gè)二硫環(huán)，且肽鏈羧基末端都是脯氨酰胺基團(tuán)。天然降鈣素中以魚(yú)類等脊椎動(dòng)物的活性最強(qiáng)，哺乳類動(dòng)物的降鈣素活性較弱。多種降鈣素的合成類似物，已在臨床應(yīng)用多年，主要用于治療老年性骨質(zhì)疏松、Page

2、t's癥、高血鈣癥、脊椎管狹窄癥、急性胰腺炎、胃潰瘍等。但是，天然降鈣素的半衰期短，在溶液中不穩(wěn)定，臨床應(yīng)用中需頻繁注射給藥，造成患者用藥順應(yīng)性差。為了增強(qiáng)其穩(wěn)定性、延長(zhǎng)作用時(shí)間，本課題根據(jù)已有的構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果，設(shè)計(jì)了一系列降鈣素類似物，并進(jìn)行了大分子修飾，通過(guò)評(píng)價(jià)修飾產(chǎn)物的生物活性和代謝特征，以期獲得長(zhǎng)效的降鈣素類似物。
　　 依據(jù)本課題組前期的研究結(jié)果及文獻(xiàn)調(diào)研情況，對(duì)降鈣素進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造包括：1）由于二硫鍵不是降鈣活性

3、所必需的基團(tuán)，且其在中性或堿性溶液中易開(kāi)環(huán)，是不穩(wěn)定的主要原因，故將肽鏈氨基末端1和/或7位的Cys用Val或D/L-Ala替代，設(shè)計(jì)了不含二硫鍵的非環(huán)狀類似物；2）CT的10、28位Gly殘基是非手性的，分子柔性大，用分子結(jié)構(gòu)中含有五元環(huán)而剛性較大的Pro或D-Pro替換，可改變天然肽鍵的構(gòu)型，有利于增加肽的酶解穩(wěn)定性；3）文獻(xiàn)報(bào)道，19-22位氨基酸殘基的缺失對(duì)活性影響不大，據(jù)此可獲得較短的肽鏈；4）對(duì)易酶解位點(diǎn)Lys11以胍氨酸（

4、Cit）替換，增加其酶解穩(wěn)定性；5）大分子修飾是改善蛋白質(zhì)類藥物生物活性、理化特性及藥代動(dòng)力學(xué)特性的重要方法之一。經(jīng)大分子修飾的蛋白質(zhì)和多肽類藥物，在保持其主要生物學(xué)功能不變的前提下，表現(xiàn)出藥物水溶性提高，毒副作用和免疫原性降低，體內(nèi)穩(wěn)定性增強(qiáng)，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，水溶性增加.半衰期延長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。用于修飾蛋白質(zhì)類藥物的大分子包括聚乙二醇（PEG）、白蛋白、唾液酸和多糖等，其中PEG的應(yīng)用最為廣泛。已有多種PEG修飾的蛋白質(zhì)藥物被美國(guó)食品與藥品監(jiān)

5、督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，成為獲得長(zhǎng)效蛋白質(zhì)類藥物的重要技術(shù)方法之一。經(jīng)PEG修飾的CT藥物，其在組織勻漿中的穩(wěn)定性增加的原因可能是大分子PEG能降低蛋白酶對(duì)CT的水解作用。據(jù)此，對(duì)CT類似物進(jìn)行PEG修飾，達(dá)到提高其穩(wěn)定性延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間的目的。然而，多肽和蛋白質(zhì)中通常含有多個(gè)可與PEG偶聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)，如CT的肽鏈氨基末端α-氨基和Lys11，18的ε-氨基，均可同時(shí)發(fā)生PEG化反應(yīng)。由于反應(yīng)選擇性的問(wèn)題，往往易形成混合產(chǎn)物，這是造

6、成PEG修飾產(chǎn)物生物活性減小乃至喪失的重要因素。本課題將利用巰基的高反應(yīng)活性，在肽鏈中保留一個(gè)Cys并選取能夠特異性與巰基偶聯(lián)的PEG修飾劑，獲得定點(diǎn)單PEG修飾產(chǎn)物。
　　 目的：對(duì)CT原型藥中某些位點(diǎn)氨基酸殘基進(jìn)行替換，以期得到活性較好、生物穩(wěn)定性高的CT類似物，同時(shí)進(jìn)一步探討CT的構(gòu)效關(guān)系；另一方面，選擇活性較好的CT類似物進(jìn)行PEG修飾，進(jìn)一步做動(dòng)物體內(nèi)的代謝研究。
　　 方法：本課題中，肽類似物的合成應(yīng)用固相多

7、肽合成法，以酰胺型MBHA和Rink Amide樹(shù)脂為固相載體，采用Fmoc/tBu正交保護(hù)策略，由肽鏈氨基端向羧基端延長(zhǎng)肽鏈。肽樹(shù)脂以三氟醋酸（TFA）或無(wú)水氟化氮（HF）裂解。粗肽以反相高效液相色譜（RP-HPLC）進(jìn)行純化及純度鑒定，以基質(zhì)輔助激光離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行分子量和PEG修飾度的鑒定。所得化合物均進(jìn)行降鈣活性評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：根據(jù)上述設(shè)計(jì)思路和實(shí)驗(yàn)方案，共合成了10個(gè)降鈣素類似物

8、及9個(gè)PEG修飾產(chǎn)物。降鈣素類似物的純度為87％～98％，合成收率為10％～22％。實(shí)測(cè)分子量與理論值一致，PEG修飾產(chǎn)物的M_ALDI-TOF-MS圖譜數(shù)據(jù)表明只有1個(gè)PEG分子偶聯(lián)到肽鏈上。
　　 結(jié)論：初步的生物活性測(cè)定表明，有4個(gè)化合物顯示了較好的降鈣活性，其中2個(gè)化合物的活性高于CT原型對(duì)照藥，但均比陽(yáng)性對(duì)照模板化合物L(fēng)K-YB低。依據(jù)活性測(cè)定結(jié)果和CT類似物的序列，對(duì)構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了初步探討：1）不含二硫環(huán)的CT類似物