紅景天苷抑制白蛋白跨腎小球內(nèi)皮細胞穿胞在改善糖尿病腎病蛋白尿中的作用與機制.pdf

1、【目的】
　　中國目前有超過1億人口患糖尿病，糖尿病腎?。―iabetic nephropahty，DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是引起終末期腎病的首要原因。微量蛋白尿是早期發(fā)現(xiàn)DN和指導(dǎo)臨床治療DN的重要指標(biāo)。有效的藥物治療并減少蛋白尿的產(chǎn)生對改善DN的進程尤為重要。紅景天苷（Salidroside，SAL）是天然植物紅景天（Rhodiola Rosea）的主要成分。最近報道紅景天苷可以抑制高糖所致的系膜細胞增生，紅

2、景天的醇提取物對 DN有保護作用，然而紅景天苷是否對DN有保護作用還不清楚。本課題主要是探究紅景天苷能否緩解糖尿病相關(guān)蛋白尿并探討其中的機制。腎小球內(nèi)皮細胞（Glomerular endothelial cell，GECs）是腎小球濾過膜的第一道屏障，在蛋白尿發(fā)生中有重要作用。由于GECs也是內(nèi)皮細胞，同時考慮到小窩蛋白（Caveolin-1，Cav-1）在白蛋白跨血管內(nèi)皮的穿胞中有重要作用，而且在Cav-1-/-鼠沒有觀察到蛋白尿，人

3、和鼠的腎臟內(nèi)皮均有Cav-1的表達，我們猜想白蛋白是否也是通過跨GECs穿胞從而產(chǎn)生蛋白尿。為了便于研究蛋白尿產(chǎn)生的機制，我們首先建立了白蛋白體外穿胞模型。同時，我們采用國際公認(rèn)的糖尿病腎病模型鼠（db/db鼠）探索紅景天苷能否緩解其腎臟病變和蛋白尿，利用建立的白蛋白體外穿胞模型研究其機制，并進一步探究其上游的信號通路。
　　【方法】
　　1.建立白蛋白體外穿胞模型
　　用異硫氰酸熒光素（Fluorescein iso

4、thiocyanate，F(xiàn)ITC）代替放射性物質(zhì)標(biāo)記白蛋白，便于示蹤觀察白蛋白穿胞。利用穿胞是由受體介導(dǎo)的并高度受調(diào)控的原理，建立白蛋白體外穿胞模型。
　　2.動物實驗
　　采用國際公認(rèn)的糖尿腎病模型db/db鼠（雄性，9周齡），用二甲雙胍（200mg/kg/day）、紅景天苷（25，50，100 mg/kg/day）、甲基-β-環(huán)糊精（MβCD，100 mg/kg/week）、N-乙基馬來酰亞胺（NEM，1.7 mg/kg

5、/week）或者生理鹽水處理小鼠11周（n=12~15）。同時，雄性9周齡db/m鼠為非糖尿病腎病組（WT組）進行對照實驗，給予等量的生理鹽水處理11周。藥物處理11周后，尾靜脈采血檢測餐后2 h血糖；用代謝籠收集小鼠24 h尿液儲存?zhèn)溆?；小鼠麻醉后，收集血液和腎臟標(biāo)本。用試劑盒檢測血肌酐、尿肌酐；用酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒檢測尿微量白蛋白，并計算尿白蛋白/

6、尿肌酐比值；新鮮腎臟組織用4％多聚甲醛固定后包埋、切片，行過碘酸雪夫染色（Periodic acid-shiff stain，PAS），檢測腎臟腎小球及系膜的形態(tài)學(xué)改變。
　　3.細胞實驗
　　利用建立的白蛋白體外穿胞模型，進一步探討紅景天苷在低糖和高糖情況下對白蛋白跨GECs穿胞的影響，同時檢測穿胞的相關(guān)分子對白蛋白跨GECs穿胞的影響；用 Western blot方法在 GECs中檢測腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosin

7、e monophosphate activated protein kinase，AMPK）、Src和Cav-1等蛋白的磷酸化情況來研究白蛋白穿胞的相關(guān)調(diào)節(jié)通路，以及在紅景天苷抑制白蛋白跨GECs穿胞中的調(diào)控作用；用AMPK siRNA和Cav-1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞分別下調(diào)AMPK和Cav-1蛋白的表達，進一步證實其在穿胞中的作用以及與紅景天苷抑制白蛋白穿胞的關(guān)系；用MitoSOXTM Red探針和JC-1探針分別檢測線粒體活性氧（M

8、itochondrial reactive oxygen species，mtROS）和線粒體膜電位的變化，進一步探討線粒體超氧化物的產(chǎn)生和線粒體膜電位與白蛋白穿胞的關(guān)系以及在紅景天苷抑制白蛋白穿胞中的作用；細胞攝取白蛋白實驗進行形態(tài)學(xué)觀察白蛋白穿胞的中間狀態(tài)，進一步證實紅景天苷與穿胞的相關(guān)分子的作用。
　　【結(jié)果】
　　1.建立白蛋白體外穿胞模型
　?。?）用FITC代替放射性物質(zhì)成功標(biāo)記白蛋白，并具有穩(wěn)定性和可操作

9、性。
　　（2）成功建立白蛋白體外穿胞模型。模型成功的關(guān)鍵必須考慮器材孔徑的選
　　擇、熒光示蹤劑的選擇、區(qū)分穿胞的白蛋白與細胞間隙漏出的白蛋白、白蛋白影響滲透壓、白蛋白的代謝等因素。
　?。?）我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)FITC-albumin穿胞的量具有濃度依賴性和時間依賴性。該模型的建立為臨床上蛋白尿的發(fā)生提供了直接的實驗依據(jù)；可用于研究其他大分子物質(zhì)的穿胞；還可用于體外藥物篩選，篩選降低白蛋白尿的藥物。
　　2.紅景

10、天苷能明顯緩解db/db小鼠糖尿病腎病
　　（1）在動物實驗中，與db/m對照組相比，db/db鼠血糖、左腎重、血肌酐、尿白蛋白/尿肌酐等指標(biāo)明顯增加（P<0.05 or P<0.01），腎小球體積和腎小球系膜增加，符合糖尿病腎病模型特征。
　?。?）紅景天苷處理動物后能顯著降低血糖、左腎重、血肌酐、尿白蛋白/尿肌酐等指標(biāo)（P<0.05 or P<0.01）。意外的是，二甲雙胍雖然可以降低db/db鼠血糖水平，但是不能減少d

11、b/db鼠尿白蛋白/尿肌酐的比值。穿胞抑制劑MβCD和NEM對血糖和血肌酐沒有明顯影響，僅降低db/db鼠尿白蛋白/尿肌酐的比值。
　?。?）與腎臟功能指標(biāo)相一致的是，腎臟PAS染色結(jié)果顯示紅景天苷可以減少db/db鼠腎小球表面積和腎小球系膜面積，緩解腎臟形態(tài)學(xué)改變，而二甲雙胍、MβCD和NEM對db/db鼠腎臟的形態(tài)學(xué)改變沒有明顯的影響。
　　3.紅景天苷可通過減少白蛋白跨GECs穿胞來抑制蛋白尿的產(chǎn)生及其機制研究

12、　?。?）在細胞實驗中，利用建立的白蛋白體外穿胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅景天苷能劑量依賴性的明顯減少低糖和高糖情況下白蛋白跨GECs穿胞，然而二甲雙胍增加低糖情況下白蛋白的穿胞，對高糖時白蛋白穿胞的影響不明顯。MβCD和NEM能減少低糖和高糖情況下白蛋白跨GECs穿胞。
　　（2）在穿胞模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMPK的激動劑AICAR、Src的抑制劑PP2均抑制高糖情況下白蛋白的穿胞，同時AMPK的抑制劑compound C可以部分恢復(fù)紅景天苷

13、抑制白蛋白在高糖時的穿胞。
　　（3）Western blot檢測發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以劑量依賴性的促進AMPK磷酸化，同時還能抑制Src和Cav-1的磷酸化；用Cav-1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cav-1表達減少的同時也抑制了白蛋白的穿胞。
　　（4）Src/Cav-1途徑和 AMPK/Cav-1途徑均參與紅景天苷抑制白蛋白穿胞：
　　Western blot檢測發(fā)現(xiàn)高糖刺激可以抑制AMPK磷酸化并且激活Src激酶

14、和Cav-1，這兩者都能增加Cav-1介導(dǎo)的白蛋白穿胞；紅景天苷可以劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)高糖引起的AMPK、Src以及Cav-1活性的改變；用AMPK siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn) AMPK表達減少的同時 Cav-1磷酸化增加，而且還促進了白蛋白的穿胞；AMPK siRNA還能部分抑制紅景天苷阻斷高糖上調(diào)Cav-1磷酸化的效應(yīng)，但是對紅景天苷阻斷Src的磷酸化沒有影響。
　?。?）Western blot檢測發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能激活低糖和

15、高糖時的AMPK，但是與紅景天苷不一樣的是，二甲雙胍促進了低糖時Src和Cav-1的磷酸化，對高糖時Src激酶和Cav-1的磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。
　?。?）Western blot檢測發(fā)現(xiàn)活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以抑制高糖時Src和Cav-1的活性。MitoSOXTM Red探針檢測發(fā)現(xiàn)高糖促進mtROS產(chǎn)生，NAC減少高糖時mtROS的產(chǎn)生，紅景天苷可以減少低糖和高糖時mtROS的產(chǎn)生；不同的是二甲雙胍增加低

16、糖時 mtROS的產(chǎn)生，對高糖時mtROS沒有明顯影響。JC-1探針檢測發(fā)現(xiàn)高糖使線粒體膜電位超級化，紅景天苷、二甲雙胍、NAC、線粒體電子傳遞鏈抑制劑CCCP都能使細胞線粒體膜電位去極化。
　?。?）白蛋白攝取實驗進行形態(tài)學(xué)觀察白蛋白穿胞的中間狀態(tài)，結(jié)果進一步證實紅景天苷抑制白蛋白穿胞及穿胞的相關(guān)蛋白的作用。
　　【結(jié)論】
　　紅景天苷通過減少白蛋白跨GECs穿胞緩解蛋白尿的產(chǎn)生。高糖加重白蛋白穿胞的作用是通過上調(diào)R