細(xì)胞黏附蛋白的篩選.pdf

1、人的大腦是人體最重要的器官之一，由數(shù)目巨大的神經(jīng)元組成。神經(jīng)元之間通過(guò)彼此相互接觸完成信息的傳遞，從而實(shí)現(xiàn)接受刺激、傳導(dǎo)興奮的功能。神經(jīng)元之間的信息傳遞是通過(guò)突觸來(lái)完成的。突觸是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能的基本結(jié)構(gòu)單位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人體大腦中大約有1015個(gè)突觸。突觸由突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜組成。其中，突觸間隙大約有20納米，上面有各種功能各異的蛋白和碳水化合物分子，具有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。突觸間隙最重要的功能就是通過(guò)突觸間隙上的蛋白質(zhì)之間的相互作

2、用，將突觸前膜和突觸后膜―粘連‖起來(lái)，完成神經(jīng)元之間的信息傳遞。這種蛋白我們稱(chēng)之為：細(xì)胞黏附蛋白。細(xì)胞黏附蛋白由三部分組成：與細(xì)胞骨架蛋白相連接的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和與其它細(xì)胞黏附蛋白相互作用的胞外結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)細(xì)胞黏附蛋白位于突觸中央，也有一些位于突觸前膜和突觸后膜反應(yīng)區(qū)的邊緣上。細(xì)胞黏附蛋白具有識(shí)別突觸前膜和突觸后膜的作用位點(diǎn)，傳導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)，協(xié)助釋放突觸囊泡的功能。同時(shí)，細(xì)胞黏附蛋白分子對(duì)于突觸的形成，成熟，分化，以及維持神經(jīng)遞

3、質(zhì)受體和離子通道的正常數(shù)量也起著至關(guān)重要的作用。突觸細(xì)胞黏附蛋白的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前，人類(lèi)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率日益上升，已經(jīng)成為威脅人類(lèi)身體健康的最可怕的殺手之一。找到更多的細(xì)胞黏附蛋白并加強(qiáng)對(duì)其功能的研究，對(duì)于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著重要的意義。雖然發(fā)現(xiàn)了一些細(xì)胞黏附蛋白，但是與數(shù)目眾多、種類(lèi)各異的突觸相比，我們知道的僅僅是冰山一角。有研究表明：細(xì)胞黏附蛋白在非神經(jīng)元細(xì)胞上表達(dá)可誘發(fā)神經(jīng)突觸的聚集。缺失一種細(xì)胞黏附蛋白

4、可能不會(huì)導(dǎo)致突觸無(wú)法形成，但是卻可以影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能，甚至?xí)?dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病?；谏鲜鼋Y(jié)論，我們將神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)篩選出能誘發(fā)突觸聚集的基因；通過(guò)基因的過(guò)表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)對(duì)其功能進(jìn)行研究從而發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附蛋白。利用該方法可以發(fā)現(xiàn)更多的細(xì)胞黏附蛋白。
　　我們對(duì)麻省理工大學(xué)Broad研究所和哈佛等著名高等院校研究所研發(fā)的最新的CCSB-Broad慢病毒表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行了篩選。該文庫(kù)是在該組織早先開(kāi)發(fā)的ORFeome8.1文庫(kù)的

5、基礎(chǔ)上，通過(guò)Gateway克隆的LR反應(yīng)技術(shù)將目的基因轉(zhuǎn)移到pLX304-Blast-V5載體上得到的。Gateway克隆技術(shù)是目前最先進(jìn)的克隆技術(shù)之一，具有高效，快速，靈活的優(yōu)點(diǎn)。由于CCSB-Broad慢病毒表達(dá)文庫(kù)中缺少222個(gè)大小在3Kb以上的基因，因此在正式篩選前我們也采用Gateway克隆技術(shù)中的LR反應(yīng)將缺少的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到pCDNA3.2v5-DEST載體上。LR反應(yīng)是在Xis、IHF和 Int等重組因子組成的 LR重組

6、酶混合物（LR Clonase enzyme mix）的作用下將入門(mén)載體（Entry Clone）上的目的質(zhì)粒 ORF(open reading frame)與目的載體 pCDNA3.2v5-DEST上的致死基因 ccdB基因互換，得到pCDNA3.2v5-DEST載體上含有目的質(zhì)粒的克隆產(chǎn)物的過(guò)程。酶切反應(yīng)采用的是限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ.只用一種限制性?xún)?nèi)切酶鑒定可以節(jié)約時(shí)間和成本。經(jīng)過(guò)酶切驗(yàn)證，得到所有克隆正確的質(zhì)粒。由于不能確定所有的

7、 LR克隆產(chǎn)物全都表達(dá)膜蛋白，在蛋白印跡實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證的樣品采用全蛋白。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：對(duì)3.5厘米培養(yǎng)皿培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在4微克可以達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)染效率。目前有110個(gè)LR克隆基因可以表達(dá)蛋白。
　　通過(guò)LR克隆反應(yīng)，我們得到幾乎所有的人類(lèi)基因，共有16394種，可以對(duì)人類(lèi)全基因進(jìn)行全面的篩選。
　　本實(shí)驗(yàn)形成一套穩(wěn)定的篩選方法。將1.5微克目的質(zhì)粒和0.5微克GFP-FUGW質(zhì)粒通過(guò)聚乙烯亞胺（PEI）轉(zhuǎn)染到

8、人源胚胎腎變種細(xì)胞（HEK293T）中培養(yǎng)24小時(shí)后加入培養(yǎng)九天的海馬神經(jīng)元中共同培養(yǎng)。36小時(shí)后免疫熒光染色再用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，如果目的質(zhì)粒表達(dá)的蛋白為細(xì)胞黏附蛋白，就會(huì)誘導(dǎo)突觸在 HEK293T細(xì)胞周?chē)奂?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染0.25微克陽(yáng)性質(zhì)粒就可以引起明顯的突觸聚集現(xiàn)象。因此，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新的將6中不同的質(zhì)粒等濃度混合，再轉(zhuǎn)染1.5微克混合質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行篩選。在達(dá)到篩選目的同時(shí)也節(jié)省了大量的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。