小鼠腎近端小管形態(tài)計(jì)量學(xué)研究.pdf

1、目的：近端小管起始于腎小球的尿極，是腎小管的起始段，具有較強(qiáng)的重吸收功能，原尿中的全部葡萄糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、65％的鈉離子和水、50％的尿素都在此段吸收，這種重吸收功能依賴于近端小管的上皮結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運(yùn)功能。腎近端小管也是腎缺血、缺氧及高糖應(yīng)激中易受損傷也易被修復(fù)的節(jié)段。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)按近端小管走行，將其分為曲部和直部;按超微結(jié)構(gòu)的不均一性，將近端小管分為S1、S2和S3三段，這種節(jié)段性的確立是建立在對(duì)大鼠、兔和人腎近端小管的超微結(jié)構(gòu)體視學(xué)分

2、析基礎(chǔ)上的，并且在功能研究中也得到相對(duì)應(yīng)的節(jié)段。很多小鼠近端小管的研究直接沿用這種節(jié)段性加以分析，但是，這種節(jié)段性已被證明有種屬差異。目前尚缺乏對(duì)小鼠近端小管節(jié)段性的系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)利用計(jì)算機(jī)輔助的三維重建技術(shù)，以小鼠腎組織連續(xù)切片形成的系列配準(zhǔn)的顯微圖像為基礎(chǔ)，結(jié)合超微結(jié)構(gòu)體視學(xué)的方法，分別對(duì)起源于皮質(zhì)三個(gè)水平的腎單位(SN、MN和JN)的近端小管亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如內(nèi)吞體、線粒體、微絨毛等，以及上皮的高度、管徑和管壁的容積等參數(shù)進(jìn)行研究，

3、探討其管壁超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律及轉(zhuǎn)運(yùn)能力，旨在為腎臟生理機(jī)制及腎臟病的病變過(guò)程分析提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、樹脂包埋連續(xù)切片的制備腎組織取自三只體重為25 g的C57/BL/6J小鼠，腹主動(dòng)脈逆流固定（1％戊二醛和0.1 mol/L的二甲砷酸鈉緩沖液配制，PH值7.4）。垂直于腎長(zhǎng)軸取組織塊，鋨酸后固定2h，梯度酒精丙酮脫水后樹脂812包埋。采用超薄切片機(jī)及鉆石刀進(jìn)行半薄切片，從腎被膜到腎外髓外帶，共獲

4、2.5μm厚的連續(xù)切片720張，通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色顯示組織微細(xì)結(jié)構(gòu)。
　　 2、顯微圖像獲取與配準(zhǔn)應(yīng)用“計(jì)算機(jī)-顯微鏡-數(shù)碼相機(jī)”圖像采集系統(tǒng)（Olympus AX70顯微鏡;Olympus DP50相機(jī)，東京，日本），對(duì)連續(xù)切片進(jìn)行顯微鏡下拍照。最終獲得的圖像大小為2596×1889像素，每個(gè)像素相當(dāng)于1.16μm×1.16μm。圖像配準(zhǔn)過(guò)程在計(jì)算機(jī)Windows平臺(tái)上操作。其原理是，通過(guò)比較相鄰兩幅圖像內(nèi)生理對(duì)應(yīng)點(diǎn)的像素灰度值

5、的相似性來(lái)確定每個(gè)圖像平移及旋轉(zhuǎn)，使其達(dá)到生理空間的一致。其過(guò)程是，首先得出相鄰兩幅圖的相對(duì)變換值（平移距離和旋轉(zhuǎn)角度），再通過(guò)求相對(duì)變換值的相加函數(shù)得出系列圖像中的每幅圖的絕對(duì)變換值，從而實(shí)現(xiàn)圖像配準(zhǔn)。
　　 3、計(jì)算機(jī)輔助的近端小管數(shù)字追蹤對(duì)成鼠腎單位腎小管進(jìn)行數(shù)字追蹤，追蹤是通過(guò)C語(yǔ)言設(shè)計(jì)的程序在計(jì)算機(jī)Linux平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)的。近端小管的追蹤起于腎小球尿極，終止于近端小管直部和髓袢降支細(xì)段上皮移行部。本實(shí)驗(yàn)追蹤了3只小鼠15

6、0條近端小管，追蹤過(guò)程自動(dòng)生成一個(gè)數(shù)據(jù)文件，記錄追蹤小管走行的空間坐標(biāo)?；诖俗鴺?biāo)集，近端小管走行的毗鄰關(guān)系分析，以及小管長(zhǎng)度測(cè)量等得以實(shí)現(xiàn)。小管長(zhǎng)度的測(cè)量運(yùn)用歐幾里德算法(n∑i=2√(xi-xi-1)2+（yi-yi-1）2+（zi-zi-1）2，即，累加沿近端小管走行的每?jī)蓚€(gè)連續(xù)點(diǎn)的距離，得出沿近端小管走行任意兩點(diǎn)之間的距離。
　　 4、體視學(xué)分析從腎小球開始到近端小管末端沿小管縱軸每隔300-400μm取切片獲得超微結(jié)構(gòu)

7、圖像，采用點(diǎn)計(jì)數(shù)法，利用10mm網(wǎng)格測(cè)試系統(tǒng)，在近端小管發(fā)放大倍數(shù)15600×的電鏡圖像上測(cè)細(xì)胞內(nèi)吞體、溶酶體、線粒體等的體積密度。在2100×的電鏡圖像上測(cè)微絨毛長(zhǎng)度、上皮高度、小管內(nèi)外徑等參數(shù)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 小鼠近端小管全程具有較為一致的超微結(jié)構(gòu)，即，細(xì)胞游離面被覆長(zhǎng)而致密的微絨毛，頂端細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有許多大小不一的內(nèi)吞體和頂端致密小管，在細(xì)胞頂端和細(xì)胞核之間有豐富的溶酶體和散在的線粒體，核下方和基底膜之間有垂

8、直排列的質(zhì)膜內(nèi)褶，褶之間可見有桿狀的線粒體。在近端小管的起始部，以及直部與細(xì)段移行處，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化明顯。近端小管曲部細(xì)胞的頂端有大量的脂滴和溶酶體，并且在起源于SN和MN的近端小管距腎小球900到2400μm段中，觀察到細(xì)胞內(nèi)存在有成層或者不均勻的高電子密度的溶酶體，但在JN中沒有觀察到。
　　 形態(tài)計(jì)量學(xué)研究結(jié)果顯示，小鼠近端小管刷狀緣的高度不同于大鼠，全程變化不大，平均值約為2.7μm。管腔直徑?jīng)]有規(guī)律的節(jié)段性變化，平均值為

9、22μm。SN和MN的近端小管細(xì)胞中，包括溶酶體的內(nèi)吞體的體密度在近端小管曲部的中部有一個(gè)高峰為4％，在近端小管最后1000μm降低到2％，雖然沿近端小管有微小波動(dòng)，但是沒有看到像大鼠和人近端小管的節(jié)段性。SN、MN和JN的近端小管細(xì)胞中的線粒體的體密度平均值為44％，全程較為一致，沒有發(fā)現(xiàn)大的節(jié)段性變化。
　　 結(jié)論：
　　 超微結(jié)構(gòu)及體視學(xué)分析表明，該種屬小鼠腎近端小管在溶酶體和線粒體的體密度、上皮高度、微絨毛高度等