大鼠動脈硬化模型的形態(tài)計量學研究及藥物干預(yù)作用觀察.pdf

1、[目的]
　　 用大劑量維生素D3聯(lián)合動物油誘導(dǎo)大鼠動脈硬化，根據(jù)模型大鼠動脈硬化的特點，建立相應(yīng)血管形態(tài)計量學方法，定量研究動脈硬化的兩大結(jié)構(gòu)性病變血管中層彈性纖維鈣化和動脈重構(gòu)，并觀察血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利、黑芝麻油、白藜蘆醇、對動脈硬化的干預(yù)作用。
　　 [方法]
　　 SPF級雄性SD大鼠46只，隨機分為正常對照組、模型組、卡托普利組、黑芝麻油組和白藜蘆醇組，正常對照組和模型組各10只，卡托普利組

2、8只，黑芝麻油組和白藜蘆醇組各9只。模型組大鼠在實驗1～3天灌胃200，000IU kg-1d-1維生素D3注射液，4～49天灌胃4ml kg-1d-1豬油；卡托普利、黑芝麻油和白藜蘆醇各干預(yù)組大鼠在7～49天分別再給予60mg kg-1d-1卡托普利、5ml kg-1d-1黑芝麻油、50mg kg-1d-1白藜蘆醇治療。實驗結(jié)束時，心臟取血處死大鼠，收集血液離心取血清，測定血脂、血鈣、血磷、血清堿性磷酸酶等血液學指標；稱取左肺、肝、脾

3、、左腎等計算其濕重指數(shù)并觀察其大體變化。將心臟連同整條主動脈一起取出，剝離干凈后固定。制作胸主動脈、主動脈根部及心臟病理切片，經(jīng)HE染色、Von Kossa染色、彈性纖維與膠原纖維雙重染色以及M-G T染色后，分別在普通光及熒光下觀察動脈硬化血管組織學及幾何形態(tài)變化，根據(jù)動脈硬化特點，建立相應(yīng)的血管形態(tài)計量學方法，使用專業(yè)病理圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0定量研究大鼠心血管系統(tǒng)病變。
　　 [結(jié)果]
　　

4、 1大鼠動脈硬化模型形態(tài)學觀察及定量研究1.1大劑量維生素D3聯(lián)合動物油可致大鼠胸主動脈血管中層彈性纖維鈣化模型組大鼠胸主動脈鏡下形態(tài)學觀察可見，血管壁中層原有的血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)檐浌菢蛹毎?，其周圍被大量軟骨樣基質(zhì)所包裹，軟骨樣細胞輪廓和軟骨樣基質(zhì)其主要成分為膠原纖維(經(jīng)CF/EF雙重染色后均被染為紅色)，在膠原纖維上沉積著大量鈣質(zhì)(經(jīng)HE染色后膠原被染色深藍色)，因此病變區(qū)域已形成軟骨樣礦化區(qū)。此時，病變區(qū)域彈力蛋白已降解斷裂，

5、殘留的彈力纖維仍可見沉積著大量鈣質(zhì)，彈力蛋白的降解可能早于血管平滑肌細胞表型的轉(zhuǎn)變和礦化(病變區(qū)域可見已降解斷裂的彈性纖維片段，熒光下可見熒光殘跡)。
　　 1.2大劑量維生素D3聯(lián)合動物油可致大鼠胸主動脈血管重構(gòu)胸主動脈壁組織學變化：與正常組相比，模型組大鼠胸主動脈壁中血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化失去細胞形態(tài)、CF％增加106％，P<0.01；CF/EF(膠原纖維與彈性纖維的比值)較正常組增加162％，P<0.01，管壁沉積大量鈣質(zhì)

6、，鈣化受損面積百分比高達85.8％。
　　 胸主動脈幾何形態(tài)學的改變：血管內(nèi)、外徑較正常組等比例地增加約24％；管腔面積、血管壁橫截面積較正常組等比例地增加約45％；血管內(nèi)外徑的比值、壁腔徑比與壁腔面積比不變；胸主動脈血管壁呈局部增厚，其增厚處血管長度占整個血管總長度的比值即增厚指數(shù)為18％，同時伴有局部變薄和血管壁分離現(xiàn)象，其變薄處及分離處血管長度占整個血管總長度的比值即變薄指數(shù)與分離指數(shù)分別為27％、44％，胸主動脈血管壁破

7、損面積百分比達19.8％。
　　 1.3大劑量維生素D3聯(lián)合動物油可致大鼠主動脈根部擴張及鈣化主動脈根部血管壁組織學的變化：模型組大鼠主動脈根部管壁中層血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)檐浌菢蛹毎?，大量鈣質(zhì)沉積于血管壁中層，主動脈根部血管壁鈣化嚴重，其鈣化面積百分比達16.55％，正常組大鼠主動脈根部血管壁有少量鈣質(zhì)沉積，其鈣化面積百分比為2.07％。
　　 主動脈根部血管腔擴張：與正常組比較，模型組大鼠主動脈根部血管腔面積增加5

8、3％，主動脈根部血管腔擴張。
　　 1.4大劑量維生素D3聯(lián)合動物油可致大鼠心肌血管擴張及數(shù)量增加與正常組比較，模型組大鼠單位面積心肌中血管數(shù)量增加48％，P<0.05；與正常組比較，模型組大鼠單位面積心肌中血管面積增加185％，P<0.01，模型組大鼠單個心肌血管所占心肌面積平均增加88％，心肌血管不僅數(shù)量顯著增加，且心肌血管管腔出現(xiàn)明顯生長和擴張。
　　 1.5大劑量維生素D3聯(lián)合動物油對大鼠體重與血液學指標變化的影

9、響大鼠體重的變化：與正常組相比，模型組大鼠體重較正常組有下降趨勢，2w～4w體重下降最明顯，但無統(tǒng)計學意義，5w時模型組大鼠體重恢復(fù)至正常組水平，6w、7w體重變化趨勢與正常組相同。
　　 大鼠重要器官指數(shù)的變化：與正常組相比，模型組大鼠腎、肺、肝、脾等各內(nèi)臟器官指數(shù)即內(nèi)臟重量與體重的比值均無變化。
　　 大鼠血脂水平的變化：與正常組相比，模型組大鼠血清HDL-C水平較正常組顯著下降，P<0.05，血清TC、LDL-C、

10、TG水平較正常組有上升趨勢但無統(tǒng)計學意義。
　　 大鼠血鈣、血磷及鈣磷乘積的變化：與正常組相比，模型組大鼠血清磷水平及鈣磷乘積均顯著升高，P<0.05&P<0.05，模型組大鼠血鈣水平較正常組無顯著變化。
　　 2卡托普利、黑芝麻油、白藜蘆醇對大鼠動脈硬化的干預(yù)作用2.1卡托普利對大鼠動脈硬化的干預(yù)作用卡托普利可顯著降低大鼠血管鈣化程度：與模型組相比，卡托普利干預(yù)組大鼠胸主動脈重度鈣化面積百分比和主動脈根部血管壁鈣化面積

11、百分比均顯著降低(主動脈重度鈣化面積百分比，VD3:81.7±2.66％；Captopril：43.58±2.66％，P<0.01；主動脈根部血管壁鈣化面積百分比，VD3:16.55±1.58％；Captopril：9.75±1.60％，P<0.01)。
　　 卡托普利可顯著降低血管壁膠原纖維的百分比含量：與模型組相比，卡托普利干預(yù)組大鼠胸主動脈血管壁膠原纖維面積百分比降低20％，P<0.05。
　　 卡托普利對心肌血管

12、的影響：與模型組相比，卡托普利干預(yù)組大鼠單個心肌血管所占面積較模型組平均減小30％，因此心肌血管管腔擴張程度較模型組有所減輕，卡托普利干預(yù)組大鼠心肌血管數(shù)量較模型組有所增加，但無統(tǒng)計學意義。
　　 卡托普利對血清HDL-C水平的影響：卡托普利可使血清HDL-C數(shù)值上升高到正常組水平(Control：0.63±0.07mmol/L；Captopril：0.62±0.14 mmol/L，P>0.05)，但與模型組相比，卡托普利干預(yù)組

13、無統(tǒng)計學意義。
　　 2.2黑芝麻油對大鼠動脈硬化的干預(yù)作用黑芝麻油可顯著降低大鼠胸主動脈血管鈣化程度；與模型組相比，黑芝麻油干預(yù)組大鼠胸主動脈鈣化受損面積百分比(VD3:85.83±2.63％；Melan-sesame oil：30.85±8.73％，P<0.01)、重度鈣化面積百分比(VD3:81.7±2.66％；Melan-sesame oil：20.85±7.95％，P<0.01)均顯著降低；同時與模型組相比，黑芝麻油干

14、預(yù)組大鼠血清HDL-C水平顯著升高(VD3:0.46±0.12mmol/L；Melan-sesameoil：0.59±0.07mmol/L，P<0.05)，認為血管鈣化程度的降低與血清HDL-C水平的顯著升高有關(guān)。
　　 黑芝麻油可顯著降低血管壁膠原纖維的百分比含量：與模型組相比，黑芝麻油干預(yù)組大鼠胸主動脈血管壁膠原纖維面積百分比降低19％，P<0.05。
　　 黑芝麻油可顯著降低血管壁破損面積百分比：與模型組相比，黑芝

15、麻油干預(yù)組大鼠胸主動脈血管壁破損面積百分比下降48％，P<0.05。
　　 黑芝麻油對胸主動脈幾何形態(tài)的影響：與模型中相比，黑芝麻油干預(yù)組大鼠胸主動脈內(nèi)徑、內(nèi)外徑比值顯著較小(LD，VD3:2191±167.3μm；Melan-sesameoil：1807±382.2μm，P<0.05；LD/ED，VD3:0.89±0.01；Melan-sesame oil：0.82±0.07，P<0.05)、壁腔徑比顯著增加(WT/LD，VD

16、3:0.06±0.01；Melan-sesame oil：0.11±0.05，P<0.05)，血管壁有內(nèi)向型重構(gòu)趨勢。
　　 黑芝麻油對心肌血管的影響：與模型組相比，黑芝麻油干預(yù)組大鼠單位心肌面積中心肌血管面積無變化(VD3:15.78±5.03μm2/1000mm2；Melan-sesameoil：15.92±7.27μm2/1000mm2，P>0.05)，單位心肌面積中心肌血管數(shù)量顯著減少(VD3:526±106個/1000

17、mm2；Melan-sesame oil：302±61個/1000mm2，P<0.01)，模型組大鼠單個心肌血管所占面積為1.06/35=0.030mm2/個，黑芝麻油干預(yù)組大鼠單個心肌血管所占面積為1.27/24=0.053mm2/個，與模型組相比，黑芝麻油干預(yù)組大鼠單個心肌血管所占面積平均增加(0.053-0.030)/0.030≈77％，提示黑芝麻油可使心肌血管生長擴張，而使單位心肌面積中心肌血管數(shù)量顯著減少接近正常組水平(Con

18、trol：355±103個/1000mm2；Melan-sesame oil：302±61個/1000mm2，P>0.05)。
　　 黑芝麻油對主動脈根部管腔的影響：與模型組比較，黑芝麻油干預(yù)組大鼠主動脈根部管腔面積及總面積顯著減小接近正常組水平(管腔面積，Control：7.86±2.69 mm2；VD3:12.05±3.54 mm2；Melan-sesame oil：6.56±1.85mm2，P<0.01with Melan

19、-sesame oil versus VD3；總面積，Control：9.63±2.77mm2；VD3：14.15±3.75mm2；Melan-sesame oil：8.43±2.23mm2，P<0.05 with Melan-sesame oilversus VD3)，提示黑芝麻油可使主動脈根部管腔擴張程度減小。
　　 黑芝麻油可使大鼠心肌面積增加：黑芝麻油干預(yù)組大鼠心肌面積較正常組和模型組顯著增加(Control：65.76

20、±6.30mm2；VD3:67.3±10.41mm2；Melan-sesameoil：81.39±10.21mm2，P<0.01 with Melan-sesame oil versus VD3)。
　　 2.3白藜蘆醇對大鼠動脈硬化的干預(yù)作用白藜蘆醇可顯著降低血管壁膠原纖維的百分比含量：與模型組比較，白藜蘆醇干預(yù)組大鼠血管壁膠原纖維面積百分比下降33％，CF/EF比值顯著降低，P<0.01&P<0.05。
　　 白藜蘆

21、醇對大鼠胸主動脈破損程度的影響：與模型組比較，白藜蘆醇干預(yù)組大鼠胸主動脈血管壁破損面積百分比有所下降(Dmg％，VD3:19.8±8.2％；Resveratrol：13.6±4.2％，P>0.05)，但無統(tǒng)計學意義。
　　 白藜蘆醇對胸主動脈幾何形態(tài)的影響：與模型組比較，白藜蘆醇干預(yù)組大鼠胸主動脈內(nèi)外徑比值即LD/ED顯著較小(LD/ED，VD3:0.89±0.01；Resveratrol：0.82±0.07，P<0.05)，內(nèi)

22、徑、外徑均有所下降(LD，VD3:2191±167.3μm；Resveratrol：1863.3±345.2μm，P>0.05；ED，VD3:2459.3±184.9μm；Resveratrol：2220.6±306.4μm，P>0.05)，但無統(tǒng)計學意義。
　　 白藜蘆醇對主動脈根部管腔的影響：與模型組比較，白藜蘆醇干預(yù)組大鼠主動脈根部管腔面積及總面積顯著減小接近正常組水平(管腔面積，VD3：12.05±3.54mm2；Res

23、veratrol：5.74±1.71mm2，P<0.01 with Resveratrol versus VD3；總面積，VD3:14.15±3.75mm2；Resveratrol：7.89±1.99mm2，P<0.01 with Resveratrolversus VD3)，白藜蘆醇可使主動脈根部管腔擴張程度減小。
　　 白藜蘆醇對心肌血管的影響：與模型組相比，白藜蘆醇干預(yù)組大鼠單位心肌面積中心肌血管面積增加，但無統(tǒng)計學意義(

24、VD3:5.78±5.03μm2/1000mm2；Resveratrol：18.00±6.71μm2/1000mm2，P>0.05)，單位心肌面積中心肌血管數(shù)量顯著減少(VD3:526±106個/1000mm2；Resveratrol：375±91個/1000mm2，P<0.01)，因此白藜蘆醇干預(yù)組大鼠單個心肌血管所占面積為1.12/24=0.047mm2/個，與模型組相比，白藜蘆醇干預(yù)組大鼠單個心肌血管所占面積平均增加(0.047-

25、0.030)/0.030=57％，提示白藜蘆醇也可促使心肌血管生長擴張，同時使單位心肌面積中心肌血管數(shù)量顯著減少接近正常組水平(Control：355±103個/1000mm2；Resveratrol：375±91個/1000mm2，P>0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1大劑量維生素D3聯(lián)合動物油可誘導(dǎo)大鼠中層血管鈣化和重構(gòu)動脈中層血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)檐浌菢蛹毎⒈卉浌菢踊|(zhì)所包裹，病變區(qū)域沉積大量膠原纖維，構(gòu)成

26、軟骨樣細胞輪廓和軟骨樣基質(zhì)的主要成分，在膠原纖維及未降級的彈力纖維上沉積大量鈣質(zhì)，形成軟骨樣礦化區(qū)域，為典型的MEC病變。
　　 動脈重構(gòu)：動脈中層形態(tài)學觀察可見管壁局部增厚、管腔擴張、血管內(nèi)外徑的比值、壁腔徑比與壁腔面積比均不變：成分分析可見彈力蛋白降解、膠原纖維沉積，大量鈣質(zhì)沉積于動脈中層。
　　 2大劑量維生素D3聯(lián)合動物油可致大鼠主動脈根部血管壁鈣化和管腔擴張主動脈根部血管壁平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)變，管壁中層鈣化嚴重，

27、主動脈根部管腔明顯擴張。
　　 3大劑量維生素D3聯(lián)合動物油可致大鼠心肌血管數(shù)量增加和管腔擴張心肌血管不僅數(shù)量顯著增加，且心肌血管管腔出現(xiàn)明顯生長和擴張。
　　 這些改變說明了大劑量維生素D3聯(lián)合動物油可造成動脈硬化的大鼠動物模型，該模型與人類動脈硬化明顯有許多相似的地方，該動物模型可用于觀察各種藥物的預(yù)防和治療作用。
　　 4卡托普利對大鼠動脈硬化的緩解作用卡托普利可顯著降低大鼠胸主動脈和主動脈根部血管鈣化程度

28、，降低胸主動脈血管壁膠原纖維的百分比含量，使心肌血管擴張程度減小，對心肌血管數(shù)量影響不顯著。
　　 5黑芝麻油對大鼠動脈硬化的干預(yù)作用黑芝麻油可顯著降低大鼠胸主動脈血管鈣化程度，升高血清HDL-C水平；顯著降低胸主動脈血管壁膠原纖維面積百分比含量，使胸主動脈血管壁破損程度減??；使胸主動脈血管內(nèi)徑及內(nèi)外徑比值減小，壁腔徑比增加，有內(nèi)向型重構(gòu)趨勢；使主動脈根部血管腔擴張程度減小接近正常水平；使心肌血管擴張程度增加，心肌血管數(shù)量顯著減