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文檔簡介
1、第一部分巖黃連中小檗堿型生物堿生物合成途徑相關(guān)基因的研究巖黃連為罌粟科植物石生黃堇(Corydalis saxicola Bunting)的全草,是一種名貴的中藥材主要分布在貴州,云南,四川,廣西等省,對環(huán)境條件要求十分苛刻,野生狀態(tài)下只生長在石灰?guī)r地區(qū)陰濕的巖洞口,被列入中國南部瀕危植物名錄。巖黃連具有清熱解毒、利濕、止痛止血之功效,在臨床上主要藥理活性有抗菌,抗病毒,抗癌。
巖黃連中的活性成分為小檗堿型生物堿類化合物,
2、而這類化合物具有潛在的抗HBV 活性和肝保護活性。
本文對巖黃連中小檗堿類生物堿生物合成途徑中的相關(guān)酶基因進行了克隆、表達及功能分析。
巖黃連中(S)-四氫小檗堿氧化酶的克隆,表達及功能分析(S)-四氫小檗堿氧化酶是小檗堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,是黃連小檗堿的合成途徑中最后一個酶,將(S)-四氫小檗堿氧化成小檗堿。通過RACE 獲得了(S)-四氫小檗堿氧化酶cDNA 全長序列,其長度為1127bp,含有5 '
3、-UTR,3'-UTR,ploy (A)+結(jié)構(gòu)以及一個699bp的開放閱讀框架,編碼232個氨基酸殘基,預測分子量為25.20kDa。
將該基因注冊到GenBank,編號為HQ393909。RT-PCR分析表示(S)-THBO在巖黃連植株的根、莖、葉、花中都有表達,在根中表達量最高。誘導實驗表明(S)-THBO 具有明顯的防御作用。
將(S)-四氫小檗堿氧化酶構(gòu)建表達載體并在大腸桿菌中表達,并對表達(S)-四
4、氫小檗堿氧化酶的大腸桿菌對底物進行體內(nèi)轉(zhuǎn)化。表達(S)-四氫小檗堿氧化酶的大腸桿菌可以體內(nèi)轉(zhuǎn)化(S)-四氫小檗堿氧化成小檗堿,但對底物有一定的選擇性,不能將內(nèi)消旋四氫小檗堿轉(zhuǎn)化完全。
巖黃連中(S)-去甲烏藥堿合成酶的克隆(S)-去甲烏藥堿合成酶是原小檗堿生物合成途徑中的第一個酶,它可以將多巴胺(Dopamine)和(4-羥苯乙酮4-hydroxyphenylhydroxyphenylacetaldehyde,(4-HPA
5、A))催化成(S)-去甲烏藥堿((S)-Norcoclaurine)。對巖黃連的總RNA 進行PT-PCR 得到一段(S)-去甲烏藥堿合成酶的核心片段。通過RACE 獲得了(S)-去甲烏藥堿合成酶cDNA 全長序列,其長度為1003bp,含有5'-UTR, 3'-UTR,ploy (A)+結(jié)構(gòu)以及一個621bp的開放閱讀框架,編碼207個氨基酸殘基。將該基因注冊到GenBank,編號為JF488074。
巖黃連中氫化小檗堿
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