長春花萜類吲哚生物堿合成途徑重要基因及轉(zhuǎn)錄因子功能研究.pdf

1、長春花(Catharanthus roseus L.G.Don)萜類吲哚生物堿(Terpenoid indolealkaloids，TIAs)的生物合成途徑是一個由眾多生化反應步驟構(gòu)成的復雜代謝網(wǎng)絡，受到嚴格調(diào)控。目前已經(jīng)克隆的長春花TIAs合成途徑相關的基因和轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)量超過了三十個，有關的酶和基因研究工作也開展了多年，TIAs合成途徑的大體路徑基本清晰，但是現(xiàn)在對于調(diào)控TIAs合成的關鍵酶仍然不清楚。迄今為止，還沒有一個在相同的

2、實驗條件下所做的基因表達的專門比較實驗報道。針對這種狀況，本研究首次開展了在相同實驗條件下的基因表達比較的實驗工作。我們以生長旺盛的觀賞兼藥用植物長春花無菌苗為遺傳轉(zhuǎn)化材料，選擇長春花吲哚生物堿(TIAs)生物合成途徑上六個重要酶(DXR，G10H，STR，TDC，DAT，PRX1)為研究對象，根據(jù)它們的已知基因序列分別構(gòu)建了六個單轉(zhuǎn)植物表達載體(pCAMBIA1304++gene)；另外，還選擇與TIAs合成有關的兩個轉(zhuǎn)錄因子(ORC

3、A2，ORCA3)，根據(jù)其基因序列分別構(gòu)建了兩個單轉(zhuǎn)植物表達載體(pCAMBIA1304++gene)和一個共轉(zhuǎn)植物表達載體(pCAMBIA1304％ Orca2+Orca3)，以發(fā)根農(nóng)桿菌C58CI為介導，通過這八個基因的單獨轉(zhuǎn)化和兩個轉(zhuǎn)錄因子基因的共轉(zhuǎn)化，分別得到了大量單/共轉(zhuǎn)基因毛狀根系。經(jīng)過轉(zhuǎn)基因毛狀根系的抗性篩選、毛狀根樣品的分子生物學檢測與驗證、用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術測定轉(zhuǎn)基因毛狀根中基因的相對表達水平、以及用

4、高效液相色譜(HPLC)技術檢測轉(zhuǎn)基因毛狀根中長春質(zhì)堿和文多靈的含量，分別得到了檢測結(jié)果。
　　 通過檢測基因的相對表達水平，能夠驗證轉(zhuǎn)基因的表達與否，從而篩選出轉(zhuǎn)基因的陽性樣品做為檢測TIAs含量的材料；同時分析單轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子基因毛狀根中結(jié)構(gòu)基因的相對表達量，判斷哪些結(jié)構(gòu)基因的表達受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，從而尋找轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控靶基因。通過檢測轉(zhuǎn)化毛狀根中TIAs的含量變化，能夠確定究竟那些酶才是真正調(diào)控TIAs合成的關鍵酶，進而為指

5、導長春花次生代謝工程研究提供理論依據(jù)。因此，本研究的實驗目的是：1）篩選長春花細胞中控制TIAs生物合成的關鍵酶；2）尋找重要轉(zhuǎn)錄因子的新的調(diào)控靶基因。本研究得到以下結(jié)果：
　　 1.DXR、STR分別是TIAs合成途徑上、中游的關鍵酶。通過HPLC方法檢測六個單轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)基因和兩個單轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子基因，以及一個共轉(zhuǎn)的毛狀根樣品中長春質(zhì)堿和文多靈含量，結(jié)果證明：與實驗對照組(即C58CI，平均含量為2.77±0.652 mg/g DW)

6、相比較，六個轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品的長春質(zhì)堿含量都有提高，其中單轉(zhuǎn)Str基因毛狀根中長春質(zhì)堿平均含量最高(6.579±0.711 mg/g DW)，單轉(zhuǎn)Tdc基因和Dat基因毛狀根中長春質(zhì)堿平均含量為最低（平均含量分別為3.177±0.623 mg/g DW、3.488±0.696 mg/g DW,）。文多靈含量的檢測結(jié)果是：單轉(zhuǎn)Dxr基因和Prxl基因毛狀根中的文多靈平均含量高于其它4種單轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品，而單轉(zhuǎn)Dat基因和Tdc基因的毛狀

7、根中文多靈平均含量較低(平均含量分別為0.0414-0.0073 mg/g DW、0.044±0.0091 mg/g DW,)，幾乎與實驗對照C58C1(平均含量為0.0375±0.007 mg/g DW)相同。因此，就合成長春質(zhì)堿和文多靈而言，DXR、STR分別是TIAs合成途徑上、中游的關鍵酶，而G10H并沒有學術界所預期的那么重要，我們推論GIOH可能在一定的條件下才具有重要作用。
　　 2.PRX1是TIAs合成途徑下游

8、的一個關鍵酶。用FQ--PCR方法檢測單轉(zhuǎn)Orca3基因的毛狀根樣品，在所有檢測的各個基因中，Prxl基因的表達量最高，相對表達量平均達到12.18±1.442，遠遠高于其它基因的表達量，如此高的Prxl基因表達量，說明ORCA3能夠通過調(diào)控Prxl基因表達水平，進而調(diào)控TIAs合成途徑下游的合成速度。另一方面，HPLC檢測結(jié)果證明，單轉(zhuǎn)Prxl基因毛狀根樣品中的長春質(zhì)堿和文多靈含量都有明顯高于對照組樣品，尤其是文多靈的含量在六種轉(zhuǎn)基因

9、毛狀根樣品中達到最大，為0.1043±0.017 mg/g DW。因此，我們認為PRX1是TIAs合成途徑下游的一個關鍵酶。
　　 3.G10h很可能是ORCA2的調(diào)控靶基因。用PO-PCR方法檢測8個Orca2轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品的相對基因表達量，都得到了幾乎一致的檢測數(shù)據(jù)，平均相對表達量為1.642±0.288（即GlOh基因的表達量比實驗對照高出1.64倍）。而在檢測的8個0rca3轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品中，GlOh的平均相對表達量

10、僅為0.57士0.093。從檢測的結(jié)果分析，在0rca2和0rca3轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品的相對表達量都不高。
　　 4.Lamt和S1s基因的表達受到0RCA2和ORCA3的共同調(diào)控。經(jīng)過P-PCR方法檢測，結(jié)果表明Lamt基因在單轉(zhuǎn)Orca單轉(zhuǎn)Orca3因毛狀根樣品中的相對表達量平均分別為2.8±0.634和7.437±0.632，而S1s基因在這兩種樣品中的相對表達量平均分別是3.55士0.76和3.265士1.06。這說明La

11、mt和S1s基因的表達量明顯受到ORCA2和ORCA3的共同調(diào)控。
　　 5.Hmgr表達受到ORCA3調(diào)控。FQ-PCR檢測結(jié)果為：Hmg在Orca2 Orca3轉(zhuǎn)基因毛狀根中的相對表達量分別為1.37±0.42和6.64±1.21。這表明Hmgz的表達強烈受到轉(zhuǎn)錄因子ORCA3調(diào)控。這個實驗結(jié)果提示我們，ORCA3轉(zhuǎn)錄因子既能調(diào)控TIAs合成途徑上游的MEP途徑，保證TIAs的正常合成；同時，還通過調(diào)控Hgr基因的表達而簡單