多拷貝策略構(gòu)建瑞氏木霉外源基因系列表達(dá)載體.pdf

1、瑞氏木霉是自然界中廣泛分布的腐生性絲狀真菌，具有良好的分泌多種大分子物質(zhì)降解酶類(lèi)的能力，用瑞氏木霉作為工業(yè)菌株生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類(lèi)包括纖維素酶、半纖維素酶等，已有多年歷史。瑞氏木霉具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，某些高產(chǎn)菌株其胞外纖維素酶的主要成分-外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ的產(chǎn)量可達(dá)50mg/L，其中此啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子。 近年來(lái)，瑞氏木霉已作為基因工程宿主菌用于生產(chǎn)外源真核蛋白。瑞氏木霉所具有的優(yōu)良性能促進(jìn)了對(duì)該菌的

2、分子生物學(xué)研究和遺傳改造。國(guó)內(nèi)對(duì)瑞氏木霉的分子生物學(xué)研究報(bào)導(dǎo)不多，建立性能優(yōu)良、強(qiáng)表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前深入開(kāi)展瑞氏木霉分子生物學(xué)和遺傳育種研究中迫切需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。其中利用外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因的啟動(dòng)子在瑞氏木霉中構(gòu)建高效表達(dá)載體被廣泛的運(yùn)用。 在基因工程研究中，影響外源蛋白表達(dá)的因素包括基因拷貝數(shù)、啟動(dòng)子強(qiáng)度以及多拷貝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、宿主蛋白酶活性等。為了解除葡萄糖阻遏、提高外源蛋白的表達(dá)量，本文利用重組PCR

3、缺失瑞氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因啟動(dòng)子上的葡萄糖阻遏位點(diǎn)，并對(duì)含有CCAAT盒、Ace2結(jié)合位點(diǎn)、XlnR結(jié)合位點(diǎn)等轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合基序的功能區(qū)域采用多拷貝策略進(jìn)行了改造。 用cbh1全長(zhǎng)啟動(dòng)子(1291bp)構(gòu)建了以gus基因作為報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒pLPTG，并在pLPTG基礎(chǔ)上對(duì)cbhl啟動(dòng)子-1306～-869bp區(qū)域進(jìn)行缺失突變，構(gòu)建得到質(zhì)粒pCPTG。在pCPTG基礎(chǔ)上對(duì)含有CreⅠ結(jié)合位點(diǎn)的-709～-66

4、1bp區(qū)域進(jìn)行缺失突變，得到缺失質(zhì)?！鱬CPTG。通過(guò)分子操作，在重組質(zhì)粒△pCPTG基礎(chǔ)上插入△pCPTGcbhl啟動(dòng)子中的-805～-606bp區(qū)不同數(shù)目拷貝序列，構(gòu)建了含該功能區(qū)2、4、6拷貝序列的質(zhì)?！鱬2CPTG、△p4CPTG、△p6CPTG。 將上述6種質(zhì)粒分別與潮霉素抗性質(zhì)粒pAN7-1一起轉(zhuǎn)化瑞氏木霉蛋白酶缺陷株T.reeseiRutC30U4，挑選單個(gè)菌落并培養(yǎng)，PCR驗(yàn)證gus基因是否整合到轉(zhuǎn)化子的染色體上

5、。通過(guò)對(duì)1200多株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得了50株gus基因可能整合到染色體上的轉(zhuǎn)化子。對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果證實(shí)確實(shí)擴(kuò)增得到為GUS報(bào)告基因DNA序列。對(duì)其中的6株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行RT-PCR，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)計(jì)結(jié)果相吻合。對(duì)6株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行GUS比活測(cè)定，結(jié)果顯示T.reeseiP12(pCPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30U4轉(zhuǎn)化子)的GUS比活是U3-3(pLPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30U4轉(zhuǎn)化子)的1.34倍，T.re

6、esei△1-2(△pCPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30U4轉(zhuǎn)化子)GUS比活是U3-3的1.8倍。在此基礎(chǔ)上的多拷貝啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，在-805～-606bp區(qū)4拷貝以?xún)?nèi)，隨著cbhl啟動(dòng)子拷貝數(shù)的升高，報(bào)告基因的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，即T.reesei△2-4(△p2CPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30U4轉(zhuǎn)化子)GUS比活是U3-3的2.1倍，T.reesei△4-3(△p2CPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30

7、U4轉(zhuǎn)化子)GUS比活是L13-3的2.44倍；但拷貝數(shù)達(dá)到6(T.reesei△6-1)時(shí)，報(bào)告基因表達(dá)水平與4拷貝轉(zhuǎn)化子△4-3基本持平。 在乳糖培養(yǎng)基上分別補(bǔ)加乳糖與葡萄糖培養(yǎng)T.reeseiP12與T.reesei△1-2，測(cè)定報(bào)告基因GUS酶活。測(cè)定結(jié)果顯示在補(bǔ)加葡萄糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的T.reeseiP12GUS酶活大幅度下降，僅為補(bǔ)加乳糖培養(yǎng)基所測(cè)酶活的40％左右，證實(shí)在cbhl啟動(dòng)子-709～-661bp區(qū)域確實(shí)存