抗菌肽LfcinB15-W4，10多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建及融合表達(dá).pdf

1、隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛使用，關(guān)于藥物殘留和菌株耐藥性等問(wèn)題的爭(zhēng)論日益激烈。研究與開發(fā)更為有效，同時(shí)對(duì)人、動(dòng)物及環(huán)境安全無(wú)害的傳統(tǒng)抗生素替代品是當(dāng)今科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一?？咕挠捎诰哂杏行У目咕钚约蔼?dú)特的抗菌機(jī)制，在替代傳統(tǒng)抗生素方面顯示了巨大潛力。牛乳鐵蛋白肽(BovineLactoferricin，LfcinB)及其衍生肽具有高效廣譜抗菌等多種生物學(xué)功能。其衍生肽LfcinB15-W4,10是由15個(gè)氨基酸殘基組成的陽(yáng)離子型抗菌肽，

2、由于氨基酸序列的優(yōu)化，其功能活性較LfcinB有所提高，且本身不含稀有氨基酸和外源化學(xué)成分，所以是一種極具應(yīng)用潛力的健康安全的抗菌替代物。本研究比較了LfcinB15-W4,10和常用抗生素的體外抑菌活性，通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)LfcinB15-W4,10，為大規(guī)模生產(chǎn)LfcinB15-W4,10奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)論如下： 在體外抑菌實(shí)驗(yàn)中，化學(xué)合成LfcinB15-W4,10的總體抑菌效果比青霉素、金霉素、鏈霉素

3、、多西環(huán)素稍差，但是仍然對(duì)測(cè)試菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。根據(jù)LfcinB15-W4,10氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性設(shè)計(jì)合成編碼基因，設(shè)計(jì)非對(duì)稱粘性末端5'-CCGA/5'-TCGG，在T4DNA連接酶作用下首尾串聯(lián)成多聚體編碼序列。分別設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的接頭，將多聚體編碼基因定向插入表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-(LfcinB15-W4,10)n。經(jīng)菌落PCR和DNA測(cè)序驗(yàn)證后得到含

4、有單拷貝至七拷貝和九拷貝編碼基因的轉(zhuǎn)化子。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白質(zhì)電泳分析結(jié)果表明不同拷貝數(shù)的多聚體融合蛋白得到特異性誘導(dǎo)表達(dá)，其中四聚體融合蛋白表達(dá)水平最高，占菌體總蛋白的45％。經(jīng)Ni2+親和層析柱純化回收四聚體融合蛋白，純度達(dá)到86.3％以上，每1升細(xì)菌培養(yǎng)物可得到約73mg融合蛋白。按照每毫克四聚體融合蛋白加入5單位凝血酶進(jìn)行裂解，在25℃保溫48h可實(shí)現(xiàn)完全裂解，經(jīng)電洗脫回收得到純度在99％以上的LfcinB15-W4,10四

5、聚體。利用薄層瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)重組LfcinB15-W4,10四聚體抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923具有明顯的抑制作用。經(jīng)微量肉湯稀釋法測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)為16μg/mL。 本實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了抗菌肽牛乳鐵蛋白肽衍生肽LfcinB15-W4,10在大腸桿菌BL21(DE3)中的串聯(lián)融合表達(dá)，平均每升細(xì)菌培養(yǎng)物最終可以獲得10mg純度99％以上的具有抑菌活性的重組LfcinB15-W4,10四聚體，