瑞氏木霉CBHⅠ的結(jié)構(gòu)與糖苷合成性質(zhì)的探討.pdf

1、通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從Trichoderma reesei天然纖維素水解酶中分離純化得到一相對分子質(zhì)量約為65 000的蛋白。分別以對硝基酚-β-葡萄糖苷(pNP-Glu)，對硝基酚-β-半乳糖苷(pNP-Gal)，對硝基酚-β-纖維二糖(pNPC)對硝基酚-β-半乳糖苷(oNP-Gal)和微晶纖維素(Avicel)作為底物，均檢測出該蛋白的水解活性，并且具有CMC-Na弱活性，分析后確定該成分為CBHI。以pNP-GIu為底

2、物，45℃時，其水解酶性質(zhì)的米氏常數(shù)Km=3.04mg/ml，Vlnax=3.77μmol/rnin。 用DNS法和對硝基苯酚法分別檢測了CBH I與底物pNP-Glu在180min反應(yīng)時段內(nèi)產(chǎn)物還原糖和對硝基苯酚的含量變化。結(jié)果顯示在封閉的反應(yīng)體系中有明顯的可逆反應(yīng)存在，并出現(xiàn)了周期性振蕩特征，表現(xiàn)出了糖苷合成活性。水解產(chǎn)生還原糖和對硝基苯酚的量，呈現(xiàn)出分別為25.43±8.34min和36.25±2.50min的含量增減振蕩

3、周期。與此同時，為了證實該酶的糖苷合成活性的存在，以葡萄糖作為底物與酶反應(yīng)，得到了17.00±4.83min的葡萄糖含量周期性波狀振蕩結(jié)果。對底物為pNP-Glu，反應(yīng)15min后的產(chǎn)物乙?；幚?，進行GC/MS分析。研究結(jié)果證實了產(chǎn)物中有含二糖結(jié)構(gòu)類型成分，揭示了這個酶的糖苷合成的特點。這是首次證實瑞氏木霉能產(chǎn)生具有糖苷合成活性的CBH I。 運用激光拉曼光譜方法，對CBH I溶液進行酶分子的結(jié)構(gòu)分析。并且比較了CBH I與不

4、同結(jié)構(gòu)的底物(pNP-Glu、pNP-Gal和oNP-Gal)發(fā)生作用后酶分子的主鏈結(jié)構(gòu)、芳香族氨基酸殘基以及氫鍵的狀態(tài)的變化情況。在CBH I和分別加入底物pNP-Glu、pNP-Gal和oNP-Gal得到的拉曼圖譜中，二硫鍵的構(gòu)象都以扭-扭-反為主，“暴露”的酪氨酸分別占67.59％、68.40％、66.13％和69.24％，根據(jù)I<,850>/I<,830>的比值可以判斷酪氨酸酚羥基既可做氫鍵供體，又可以是氫鍵受體。在CBH I中