里氏木霉中糖苷酶的理性改造對于二糖合成-降解活性的影響.pdf

1、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是一種重要的工業(yè)應(yīng)用酶。它同時(shí)具有寡糖水解和合成活性，既能水解寡糖生成相應(yīng)的單糖，又能利用單糖合成寡糖。目前對于β-葡萄糖苷酶的研究方向主要集中在提高其水解活性上，而對其合成活性的研究相對較少。我們以里氏木霉胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶Cel1b蛋白作為研究對象，希望通過理性改造提高其二糖合成活性以獲得高效合成二糖的β-葡萄糖苷酶。我們首先通過同源模建模擬得到了Cel1b蛋白的三維結(jié)構(gòu)，然后將Cel1

2、b蛋白和纖維二糖進(jìn)行柔性對接，結(jié)果顯示纖維二糖的第二個(gè)葡萄糖殘基處于一個(gè)相對親水的環(huán)境(如N240)中，而其周圍仍存在部分疏水性氨基酸殘基如W173，I174，I177。我們據(jù)此提出了一個(gè)假說:β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性與其二糖結(jié)合部位氨基酸的親疏水性有關(guān)，結(jié)合部位的疏水性的降低可能有助于提高其轉(zhuǎn)糖基活性。我們進(jìn)一步通過點(diǎn)突變技術(shù)對Cel1b蛋白進(jìn)行了定點(diǎn)突變，將其活性中心的疏水性氨基酸變?yōu)榱擞H水性的氨基酸，獲得了I177S、I177S

3、/I174S、I177S/I174S/W173H等三株活性中心親水性逐漸增強(qiáng)的蛋白;并在原始蛋白基礎(chǔ)上將親水性氨基酸突變?yōu)槭杷园被?，獲得了活性中心疏水性增強(qiáng)的蛋白N240I。
　　我們通過對上述理性改造獲得的四個(gè)突變體蛋白進(jìn)行二糖合成與水解活性的鑒定，發(fā)現(xiàn)Cel1b蛋白及其突變體利用葡萄糖為底物可以合成昆布二糖、纖維二糖和槐糖三種二糖。當(dāng)活性中心的親水性增加時(shí)，其二糖合成活性增加，水解活性降低;當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)的疏水性增加時(shí)，其二糖