里氏木霉的紫外誘變和高活性纖維素酶突變株的選育.pdf

1、以纖維素、半纖維素和木質(zhì)素形式存在的生物質(zhì)原料數(shù)量豐富，發(fā)展和利用生物質(zhì)能源是實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。在生物質(zhì)原料轉(zhuǎn)化利用方面，里氏木霉(Trichoderma reesei)是產(chǎn)纖維素酶的重要菌種之一，其生產(chǎn)的纖維素酶在能源、生物防治、食品等多個(gè)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。本研究通過(guò)對(duì)里氏木霉進(jìn)行紫外誘變，以篩選出高產(chǎn)纖維素酶的突變菌株，進(jìn)一步提高其纖維素酶的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本為目的。
　　 本文基于篩選高產(chǎn)纖維素酶突

2、變菌株的目的，對(duì)里氏木霉Rut C30進(jìn)行紫外誘變，篩選突變菌株，并對(duì)其突變菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)對(duì)出發(fā)菌株和突變菌株的基因組進(jìn)行分析。
　　 對(duì)T．reesei Rut C30的孢子懸液進(jìn)行紫外線誘變，確定最佳誘變時(shí)間為40s，該劑量下致死率為83．500％，正突變率為8．679％，以剛果紅篩選培養(yǎng)基上水解圈與菌落直徑的比值(H/d)為指標(biāo)，進(jìn)行初篩，再以液體發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行復(fù)篩，最終獲得了一

3、株突變株A13，其濾紙酶活為4．328U/ml，相較于出發(fā)菌株2．786U/ml的酶活，提高了55．350％。對(duì)突變株A13進(jìn)行6代連續(xù)培養(yǎng)，酶活穩(wěn)定在4．160U/ml，其遺傳穩(wěn)定性較好。
　　 通過(guò)碳源、復(fù)合氮源、產(chǎn)酶溫度這三個(gè)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲得了突變菌株A13產(chǎn)酶的最佳條件，以1．000％微晶纖維素為碳源、0．150％蛋白胨與0．050％硫酸銨為復(fù)合氮源，產(chǎn)酶溫度為28℃的條件下，突變菌株A13的濾紙酶活為4．915U/

4、ml，比優(yōu)化前的4．160U/ml提高了18．150％。
　　 在含有微晶纖維素的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加適量的麥芽浸粉，實(shí)驗(yàn)表明，麥芽浸粉確實(shí)能促進(jìn)里氏木霉的突變株產(chǎn)出更多的纖維素酶。當(dāng)在1．000％微晶纖維素的基礎(chǔ)上添加1．000％麥芽浸粉時(shí)，濾紙酶活提高到了5．720U/ml。采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找微晶纖維素與麥芽浸粉的最佳配比。對(duì)中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果表明，在優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件下，當(dāng)微晶纖維素和麥芽浸粉