里氏木霉種間原生質體融合增強羧甲基纖維素酶的活性[外文翻譯]

1、<p>　　本科畢業(yè)論文外文翻譯</p><p><b>　　譯文：</b></p><p>　　里氏木霉種間原生質體融合增強羧甲基纖維素酶的活性</p><p>　　ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY 38 (2006) 719–723</p><p>　　V.R. Prabava

2、thy,N. Mathivanan *, E. Sagadevan, K. Murugesan, D. Lalithakumari</p><p>　　摘要：原生質體分離里氏木霉菌株用0.6M氯化鉀作為滲透壓穩(wěn)定劑裂解酶（西格瑪化工有限公司，美國）PTr2內原生質體融合菌株進行了使用與STC（山梨醇,緩沖液,氯化鈣）緩沖區(qū)40％聚乙二醇。瑞氏木霉的原生質體的融合已對再生羧甲基纖維素瓊脂（纖維素酶）選擇性培養(yǎng)基，1

3、5融合子，作進一步的研究選擇大多數(shù)展出的融合子在馬鈴薯培養(yǎng)基上，非融合子比親代菌株菌絲生長速度快和豐富的孢子。</p><p>　　清理周圍的區(qū)域，在種植時，纖維素酶融合子后代菌絲生長出現(xiàn)表明了羧甲基纖維素外高層次比非融合子（纖維素酶）的分泌CMC酶的活性高，估計有80%的融合子，比增加了兩倍米酶有兩個融合子，SFTr2和SFTr3相比,家長更緊張PTr2記錄活動。本研究結果顯示的范圍和原生質體融合技術，可以用來

4、發(fā)展缺乏內在的絲狀菌有性繁殖優(yōu)良雜交菌株的意義。</p><p>　　關鍵詞：里氏木霉；原生質體；融合；再生；羧甲基纖維素</p><p><b>　　1 簡介</b></p><p>　　里氏木霉纖維素酶是一種已知的纖維素酶生產[1]被廣泛用于降解纖維素材料和纖維素材料工藝,特別是在紡織和造紙工業(yè)此外，還用于廢水處理的應用[2]。真菌原生質體

5、是一個在生理和遺傳研究的重要工具[3,4]和基因操作能夠成功地通過在缺乏有性繁殖能力的絲狀真菌原生質體融合的實現(xiàn)[5]。因此，原生質體融合是在菌種改良計劃的重要途徑之一[6]。分離,原生質體融合和再生方面已取得木霉屬為主，以提高其生物防治潛力[7,8]。然而，有限的嘗試了改進,以提高木霉菌株產酶[1,9]。因此，目前正在利用這一木霉菌株提高酶的生產工藝的改進余地很大。在這種背景下，目前的工作目的為里氏木霉菌株的原生質體，開展的調查在細胞

6、外羧甲基纖維素酶（纖維素酶）的融合株后代的生產目標,內原生質體融合株。</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p>　　2.1 里氏木霉的培養(yǎng)</p><p>　　甲木霉菌菌株分離出了一大批來自不同的土壤和分解有機物的特點記錄并在我們的實驗室維護。定性和定量篩選外溶解酶，導致在選擇瑞氏木霉菌株PTr2，一個纖維素酶生產，

7、并用于培養(yǎng)原生質體融合方案。瑞氏木霉培養(yǎng)維持在含有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）的試管或錐形瓶里在室溫（28土2oC）。</p><p>　　2.2 原生質體分離瑞氏木霉</p><p>　　對瑞氏木霉（PTr2）接種是在一個錐形燒瓶中加入5毫升無菌水并輕輕搖晃5分鐘培養(yǎng)5天.關于接種1毫升（lx10/毫升孢子），從這個孢子懸液轉移到100毫升馬鈴薯葡萄培養(yǎng)基并在轉速100的室溫下?lián)u床搖16

8、個小時。培養(yǎng)好的新一代菌絲用濾紙過濾。提取100毫克的新鮮菌絲體用無菌蒸餾水洗滌，接著用0.1 MPH為6.0的磷酸緩沖液沖洗并放到含磷酸濃度為8毫克每毫升滲透壓為0.6的氯化鉀緩沖液中.菌絲的混合物培養(yǎng)在具有75轉的速度在室溫下振動篩。在菌絲體和原生質體溶解間隔30分鐘后放到光學顯微鏡下觀察。經過3小時，酶的原生質體混合物用消毒棉花消毒的100轉秒的離心機中離心10分鐘。提取原生質體的上清液去掉沉淀物緩沖液滲透壓穩(wěn)定劑的解決方案。&l

9、t;/p><p>　　2.3 原生質體融合</p><p>　　里氏木霉原生質體融合由Stasz[ll]等人提出來的。用聚乙二醇（PEG）（3500兆瓦，美國西格瑪化工有限公司）（0.6M山梨醇；的1O mM的Tris -鹽酸：10mM氯化鈣，pH值6.5）來配置緩沖液。一毫升原生質體懸浮液（約1×106原生質體/毫升）與等體積的80％PEG溶液融合混合物在室溫下培養(yǎng)10分鐘后。稀釋

10、的混合物與STC的緩沖1mL。</p><p>　　2.4 融合再生和非原生質體融合</p><p>　　用聚乙二醇沖洗混合物融兩次，使用STC緩沖液使用瑞氏木霉原生質體融合離心10分鐘100轉收集。這些融合原生質體懸浮在100微升STC的緩沖液和2％纖維素酶選擇性培養(yǎng)基。接種在含有纖維素酶的馬鈴薯培養(yǎng)基的平板上使再生菌落分離和傳代。將融合原生質體滴上0.6M氯化鉀液滲透壓穩(wěn)定劑放在顯微鏡

11、上觀察并拍照。瑞氏木霉的非融合原生質體作為對照組。</p><p>　　2.5 融合子，非融合子和親本里氏木霉在纖維素酶的選擇培養(yǎng)基生長狀況</p><p>　　約15融合子（SFTrl - SFTr15）在被選定的里氏木霉根據(jù)其選擇性培養(yǎng)基上快速增長。兩個非融合子（NFTrl和NFTr2）被選中來與融合子的變化相比較。 非融合子和親本。每一個融合子菌絲斷裂，非融合子和親本都被放置在纖維素

12、選擇培養(yǎng)基中，放在室溫下培養(yǎng)。3-5天后觀察菌絲生長，形態(tài)，色素沉著和產孢。</p><p>　　2.6 纖維素酶生產的融合株，融合子和非親代菌株</p><p>　　該融合子，瑞氏木霉的非融合子與親代菌株進行了檢查，發(fā)現(xiàn)產生了胞外纖維素酶。CMCB的介質組成（克 l- I蒸餾水）羧甲基纖維素鈉 5.0；NaN03，2.0；K2 HP04，1.0； KCI，0.5； MgS04，0.5和F

13、eS04，0.01，pH值6.5是用于培養(yǎng)瑞氏木霉。所有菌株生長在50毫升的CMCB于250 mL錐形瓶中。每一瓶被接種1毫升分生孢子懸液（1x 107毫升分生孢子）和在室溫下放在100轉搖床中培養(yǎng)。一式三份瓶均保持相同的壓力。經過6天的培養(yǎng)，用玻璃漏斗和濾紙過濾后以10,000 rpm4℃離心。在細胞發(fā)酵液被用作纖維素酶檢測酶的來源。</p><p><b>　　2.7 蛋白質估計</b>

14、</p><p>　　培養(yǎng)濾液中的蛋白質含量估計使用的染料布拉德福德結合的方法[12]。蛋白質的數(shù)量，計算用牛血清白蛋白為標準分數(shù)（西格瑪化工有限公司，美國）。</p><p>　　2.8 纖維素酶檢測</p><p>　　該法是由0.1 ml培養(yǎng)液和0.9毫升含1％羧甲基纖維素（CMC）在100毫米檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.0）制備的接種于55℃水浴中振蕩?？刂?，

15、沒有酶，底物和酶均維持煮沸。1 5分鐘后，還原糖反應混合物中形成的硝基水楊酸，使用米勒[13]試劑法。一個單位酶活性定義為在標準試驗條件產生1微升CMC所使用標準葡萄糖糖是量。</p><p><b>　　3 結果</b></p><p>　　3.1 原生質體的分離</p><p>　　里氏木霉菌絲體培養(yǎng)與裂解酶（西格瑪化工有限公司）導致細胞壁

16、和原生質體釋放溶解。瑞氏木霉菌絲體溶解后2小時開始初步觀察細胞含量。3小時后幾乎所有的菌絲體和原生質體釋放完全（圖1）。剛剛公布的原生質體的菌絲出的體積小，但后來他們慢慢地擴大到一個球形結構。</p><p>　　3.2 原生質體融合</p><p>　　將原生質體用PEG溶液混合，觀察它們粘在一起時的變化。后來，在雙方的接觸處質膜溶解原生質體融合（圖2）。隨后，核原生質體融合配對（同性配

17、子之互相融合）在許多情況下和某些情況下，對雙核階段進行了觀察。最后，原生質體融合成為單一的，大，圓形或橢圓形結構。</p><p>　　3.3 再生融合和非融合原生質體融合株菌株的選育</p><p>　　瑞氏木霉的原生質體的融合開始后2-3天（圖3）基菌絲體進行選擇性培養(yǎng)。菌落經過4天的生長觀察2％纖維素酶的生長狀況。菌絲生長的基礎上，挑選15個快速增長的瑞氏木霉融合子菌落，指定為SFT

18、rl- SFTr15。然而，3天后非融合原生質體沒有在培養(yǎng)基上生長。他們通常需時超過4天的生長，原生質體才較緩慢融合。一天之后兩個非融合子再生菌落會出現(xiàn)的選擇性培養(yǎng)基上并快速增長，相對于其他群體，它們通常需要5天以上。這些被指定為NFTrl和NFTr2。</p><p>　　3.4 融合子，非融合子與親代菌株生長的纖維素酶馬鈴薯培養(yǎng)基載體</p><p>　　所有15個融合子表現(xiàn)出的瑞氏木

19、霉菌絲菌落在PDA生長大量孢子比非融合子與親代菌株茂盛。對其中突出的融合子，非融合子和親本的變化進行了觀察。里氏木霉的融合子，非融合子與親代菌株在纖維素選擇培養(yǎng)基的增長，不同菌株之間的周圍區(qū)域明顯不相似。最明顯的融合子區(qū)的外觀較大表明在這些融合子胞外纖維素酶產量高的水平。有趣的是融合子菌株在纖維素選擇培養(yǎng)基上與親本和非融合子相比菌絲生長展出，色素沉著，產孢有很大區(qū)別。然而，我們觀察到非融合子和親本上述的特點有一些變化，但這些并不顯著。&

20、lt;/p><p>　　3.5 培養(yǎng)濾液中瑞氏木霉的親本，融合子和非融合子蛋白質含量</p><p>　　在培養(yǎng)濾液中全部蛋白質含量15個融合子介于54和78微克/毫升親本66微克/毫升，非融合株菌株毫升67和68微克/毫升。 最大的蛋白量估計在融合子SFTr1培養(yǎng)濾液中，最低在的融合子SFTr13培養(yǎng)濾液中（圖4）。</p><p>　　3.6 瑞氏木霉融合子的親本和

21、非融合子中的纖維素酶在在發(fā)酵液中含量</p><p>　　與非融合菌株（NFTr1和NFTr2）和親本PTr2相比，大多數(shù)融合子菌株（80％）SFTr14，SFTr13和SFTr15的纖維素酶的活性明顯增加。活性最大是融合子SFTr2的培養(yǎng)液296單位/毫升/分鐘，最低是SFTr14的培養(yǎng)液（92單位/毫升/分鐘）。在15個菌株中與親本相比，超過三分之二的融合子菌株的纖維素酶的活性增加。有趣的是融合子SFTr2纖

22、維素酶活性比親本（圖5）的增加了2.6倍。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　原生質體融合將是一個發(fā)展中的基因重組和優(yōu)良雜交種絲狀真菌的有效工具[6，11，14，1 5]。在目前的研究中，瑞氏木霉生產菌株PTr2是用于內部應變程序與原生質體融合提高外纖維素酶生產的目的。此前Das等人[16]證明了黑曲霉原生質體基因重組融合的內部通道。此

23、外，小川等 [1]取得了瑞氏木霉內特異性雜交。8毫克的STC的緩沖液中加入0.6M的氯化鉀，作為瑞氏木霉的原生質體提取裂解酶滲透壓穩(wěn)定劑。我們已經優(yōu)化了釋放的絲狀真菌木霉等[17]原生質體在我們的實驗室中使用各種不同的排列組合。有趣的是，我們觀察到原生質體釋放明顯受裂解酶濃度的影響。在低濃度，霉菌菌絲體溶解僅在尖端部分原生質體，而在高濃度的，雖然有效地溶解的菌絲體，但原生質體釋放后立即解體。在不同濃度的裂解酶下，我們發(fā)現(xiàn)最佳優(yōu)化的0.6

24、M的8毫克/毫升的氯化鉀作為滲透壓穩(wěn)定劑，木霉釋放的原生質體數(shù)量較多。</p><p>　　T. harzianum 和T. longibrachiatum已經做出了瑞氏木霉菌株原生質體融合最佳濃度為40％聚乙二醇的報道[8]。不過，Pe'er和Chet [14]認為種內原生質體融合技術應為的33％聚乙二醇。PEG的濃度是高度有效的原生質體融合的關鍵。高濃度的聚乙二醇易引起原生質體的萎縮和爆破[5，17]

25、，濃度40至60％適合不同的真菌原生質體融合。融合和非融合（控制）原生質體接種于高濃度的選擇培養(yǎng)基中（2％）作進一步的選擇。我們觀察到的融合子初期生長速度慢于3天后菌絲生長速度。不過，非原生質體融合與3天后差別不大。他們通常需時超過4天的生長原生質體才緩慢的融合。一旦傳代培養(yǎng)。融合子在馬鈴薯培養(yǎng)基上的生長速度與非融合子和和親本相比非?？?，這表明在新環(huán)境中的融合株更快的適應能力。所有的融合子菌株生長旺盛，產生的孢子并比親本和非融合子多。

26、與融合株菌株黃色色素沉著強度相比，非融合子和親本高?，F(xiàn)在我們不僅觀察親本與非融合子菌株的一些變化。這些都不重要，因為已經得到了我們的實驗室報告[23]。</p><p>　　雖然瑞氏木霉的親本，融合子和非融合子菌株的羧甲基纖維素酶活相似。菌株周圍的菌絲體區(qū)域之間差異明顯。這突出了融合子的纖維素酶比非融合子和親本有較大的提高，這可能是直接關系到改善木霉菌株融合子。對兩個融合子菌株纖維素酶定量分析也證實了，其中酶的活

27、性增加了兩倍。雖然大多數(shù)已經表明融合子菌株提高酶的活性，但也有些融合子與親本相比，表現(xiàn)出活性降低，。這表明，部分或不完整的基因重組過程中可會導致一些負面影響株融合子的地方。</p><p>　　本研究的結果清楚地表明原生質體融合技術對工業(yè)發(fā)展的重要意義[6]。此外，內瑞氏木霉菌株原生質體融合造成了的纖維素酶活性增加，大部分的融合子菌株比原來增加了兩倍多。因此。這種技術可以成功地用于開發(fā)，缺乏內在的絲狀菌有性繁殖優(yōu)

28、良雜交品系。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] Ogawa K,Ohara H,Koide T,Toyama N.Intraspecific hybridization of T. reesei by protoplast fusion[J]. Ferment Bioeng 1989;67:207–9.</p>&

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