酪氨酸激酶抑制劑在外周T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株增殖中作用及其機(jī)制研究.pdf

1、外周T細(xì)胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphomas，PTCLs)是指成熟T細(xì)胞、胸腺后T細(xì)胞及自然殺傷(NK)細(xì)胞來源的惡性血液病，異質(zhì)性高，病情發(fā)展快，是侵襲能力最高的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，約占NHL的15％，該疾病具有地域性特征，亞洲人群發(fā)病高于歐美國家，通常原發(fā)于咽喉或鼻腔部分，少數(shù)原發(fā)于皮膚，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化療方案，傳統(tǒng)的CHOP或CHOP樣方案仍被廣泛應(yīng)用，化療效果差，易復(fù)發(fā)，長期生存率僅為10％-30

2、％，預(yù)后不良。
　　T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)信號通路在T細(xì)胞發(fā)生過程及其功能發(fā)揮中有重要作用，并與外周T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)。ITK(Interleukin-2(IL-2)-inducible T cell kinase）是TCR通路的關(guān)鍵酶，在PTCLs組織中的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)炎組織，與PTCLs的惡性程度及腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，可用于疾病診斷及病情預(yù)后，是非常有潛力的抑制靶點(diǎn)。
　　BTK、IT

3、K、Syk是非受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶TEC家族的重要成員，與免疫細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖及凋亡密切相關(guān)，其過度激活或過度表達(dá)是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一。依魯替尼是布魯頓酪氨酸激酶(Bruton's tyrosinekinase，BTK)不可逆的抑制劑，通過與BTK的活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基(Cys-481)選擇性結(jié)合形成共價(jià)鍵抑制BTK的自我磷酸化激活。目前依魯替尼主要應(yīng)用于B細(xì)胞腫瘤的治療，在針對CLL、MCL、MM的臨床實(shí)驗(yàn)中具有非常好的

4、療效，臨床應(yīng)用前景可觀。同時(shí)，依魯替尼被證實(shí)對ITK也有不可逆的抑制作用。
　　目前，國內(nèi)外還未見依魯替尼對PTCLs調(diào)控作用的報(bào)道。本研究中，我們通過研究依魯替尼在PTCLs細(xì)胞株KARPAS-299 and HUT-78中的毒性作用及其作用機(jī)制，探討外周T細(xì)胞淋巴瘤的治療的新藥物。
　　目的:
　　檢測依魯替尼對外周T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（HUT-78及KARPAS-299）增殖及凋亡的調(diào)控，并探討Wnt通路在其中的作

5、用，為外周T細(xì)胞淋巴瘤的治療提供新的方法及思路。
　　方法:
　　1.設(shè)立藥物濃度梯度（0，1，10，20，50，100μmol）作用于HUT-78及KARPAS-299、正常人T細(xì)胞，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率，觀察依魯替尼對PTCLs細(xì)胞株及正常人T細(xì)胞增殖的影響。
　　2.相差顯微鏡觀察不同藥物濃度（0，10μmol）處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　3.設(shè)立藥物濃度梯度(0，1，10，20μmol)，相

6、差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用AnnexinⅤ-PI/FITC細(xì)胞凋亡雙染試劑盒測定依魯替尼處理后的細(xì)胞凋亡率，觀察依魯替尼對PTCLs細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.采用RT-PCR檢測依魯替尼處理后細(xì)胞（藥物濃度為0，1，10μmol）β-catenin及LEF-1基因mRNA的表達(dá)水平的變化，觀察依魯替尼對β-catenin及LEF-1基因表達(dá)的影響。
　　5.采用Western blot檢測依魯替尼處理后細(xì)胞(藥物濃度為

7、0，1，10，20μmol)β-catenin及LEF-1蛋白水平表達(dá)的變化，觀察依魯替尼對β-catenin及LEF-1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.依魯替尼處理HUT-78及KARPAS-299、正常人T細(xì)胞細(xì)胞后，兩種腫瘤細(xì)胞的增殖均被明顯抑制(IC50分別為13.34μmol及19.05μmol)(p＜0.01)，旱藥物濃度依賴性及時(shí)間依賴性。正常人T細(xì)胞增殖未受明顯抑制(p＞0.05)。
　　2.依魯

8、替尼處理HUT-78及KARPAS-299細(xì)胞后，兩種細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)減小，細(xì)胞數(shù)目減少，異形細(xì)胞增多。
　　3.依魯替尼處理HUT-78及KARPAS-299細(xì)胞后，兩種細(xì)胞的凋亡率均明顯升高(p＜0.01)，呈藥物濃度依賴性。
　　4.依魯替尼處理HUT-78及KARPAS-299細(xì)胞后，兩種細(xì)胞的β-catenin及LEF-1基因在mRNA水平的表達(dá)被明顯抑制(p＜0.05)，呈藥物濃度依賴性及時(shí)間依賴性。
　　5.