?；撬嵬ㄟ^PPARγ通路干預(yù)三氧化二砷引起的子代大鼠肝臟自噬性損傷的實驗研究.pdf

1、目的:慢性砷暴露與多種疾病有關(guān)，其中包括代謝性疾病。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一種核受體及配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于肝臟及脂質(zhì)含量豐富的器官中，起調(diào)節(jié)代謝的作用。在過去的研究中我們發(fā)現(xiàn)，砷可通過活性氧通路誘導大鼠胰島細胞(INS-1)的自噬性死亡。但慢性砷暴露對子代肝臟的損傷是否與自噬有關(guān)，以及砷引起的肝臟毒性是否與PPARγ相關(guān)聯(lián)尚不明確。?；撬崾且环N非必需氨基酸，主要存在于哺乳動物肝臟中，具有抗氧化、參與代謝等

2、細胞保護作用。有研究表明?；撬峥梢詼p輕砷引起的動物肝臟損傷，但其是否能防止砷引起的子代大鼠肝臟毒性及其是否通過PPARγ通路發(fā)揮干預(yù)作用尚不清楚。為了進一步探討砷對子代大鼠的肝臟自噬性損傷機制及牛磺酸的保護作用，本研究擬探討三氧化二砷(As2O3)誘導大鼠肝臟細胞的自噬作用以及?；撬岬谋Ｗo作用機制。
　　方法:本實驗以Wistar大鼠為研究對象，孕鼠暴露于濃度為2 mg/kg BW～8mg/kg BW的As2O3，及150 mg/

3、kg BW濃度?；撬峁辔负螅M行8 mg/kg BWAs2O3灌胃，至子代斷乳，后將子代大鼠繼續(xù)暴露于與母鼠相同劑量的As2O3至性成熟，共57天。測量子代大鼠的體重及肝臟重量;HE染色，觀察子代大鼠肝臟的形態(tài);用電子顯微鏡觀察子代大鼠肝臟細胞中自噬體的形成情況，計數(shù);用免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測子代大鼠肝臟中PPARγ蛋白及自噬生物標記物LC3蛋白及p62蛋白的表達情況;用RT-PCR方法檢測子代大鼠肝臟中PPAR

4、γ基因的表達情況。
　　為了進一步研究砷的肝臟毒性及?；撬岬谋Ｗo作用，本研究以HepG2細胞為研究對象，使其暴露于1μM的As2O3中24h后，利用RNA干擾技術(shù)對自噬相關(guān)基因-5(Atg5)進行RNA干擾，判斷As2O3引起的細胞自噬是否是造成細胞死亡的主要原因;并相應(yīng)用?；撬峒癙PAR激活劑羅格列酮預(yù)處理，用MTT方法檢測細胞存活率;用Western blot方法檢測細胞中PPARγ及自噬相關(guān)蛋白LC3及p62的表達情況;

5、r>　　結(jié)果:暴露于不同濃度As2O3(2 mg/kg BW～8 mg/kg BW)后，子代大鼠的肝臟重量明顯增高，經(jīng)濃度為150 mg/kg BW牛磺酸灌胃后再暴露于8 mg/kg BWAs2O3的子代大鼠肝臟的重量與8 mg/kg BW As2O3暴露組子代大鼠的肝臟臟器系數(shù)相比，明顯下降;HE染色結(jié)果顯示，隨著As2O3濃度的增加，子代大鼠肝臟細胞明顯縮小，在高暴露狀態(tài)出現(xiàn)水腫。而在?；撬岜Ｗo組，子代大鼠肝臟細胞形態(tài)未見明顯異常;

6、電子顯微鏡下可見，As2O3暴露后，子代大鼠肝臟中有自噬體形成，其數(shù)量隨著As2O3濃度的升高而增多，?；撬岜Ｗo組自噬體增多不明顯;子代大鼠肝臟中LC3-II蛋白表達隨著As2O3濃度的升高而增加，p62蛋白的變化趨勢與其相反，?；撬岜Ｗo組LC3-II蛋白表達較8 mg/kg BW As2O3暴露組LC3-II蛋白的表達量減少，而p62蛋白表達增高;子代大鼠肝臟中PPARγ蛋白及基因的表達量隨著As2O3暴露劑量的升高而明顯減少，而在牛

7、磺酸保護組，其表達量較8 mg/kg BW As2O3暴露組蛋白表達量明顯上升。
　　經(jīng)過PPARγ激活劑預(yù)處理后，HepG2細胞的存活率明顯升高，PPARγ蛋白表達量明顯升高，提示PPARγ的抑制造成了As2O3引起的HepG2細胞自噬性死亡;經(jīng)過?；撬犷A(yù)處理后，PPARγ蛋白表達量明顯升高，且HepG2細胞存活率明顯升高，細胞的自噬得到了明顯抑制。
　　結(jié)論:As2O3可引起的子代大鼠肝臟自噬性損傷;PPARγ的抑制造成