錳對(duì)海馬依賴學(xué)習(xí)記憶的損傷及?；撬岬母深A(yù)研究.pdf

1、盡管是機(jī)體必需的微量元素，錳更多的是因其急性高濃度或長期低劑量的暴露導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)毒性而受到關(guān)注。生產(chǎn)工藝的改進(jìn)及勞保措施的完善使得高濃度的職業(yè)錳暴露漸漸不再占據(jù)主導(dǎo)地位，而隨著交通工具的平民化，含錳抗爆汽油消耗劇增直接導(dǎo)致汽油燃燒后排放到大氣中各種含錳煙塵增加，農(nóng)業(yè)上含錳農(nóng)藥的推廣，醫(yī)療上含錳化合物的廣范使用…普通人群的環(huán)境錳暴露范圍在擴(kuò)大，累積暴露劑量在增長。流行病學(xué)調(diào)查認(rèn)為錳暴露累積劑量的增加與帕金森氏癥的發(fā)病率正相關(guān)。暴露

2、方式與劑量的變化直接影響了發(fā)生的結(jié)果，錳誘導(dǎo)出現(xiàn)嚴(yán)重的錐體外系癥狀已似乎不再，更多的是早期神經(jīng)精神癥狀，如頭疼、嗜睡、神經(jīng)衰弱、認(rèn)知能力降低、食欲減退等非特異性且易被忽視的綜合癥。因此，建立錳暴露動(dòng)物模型探討神經(jīng)精神癥狀有助闡明其早期神經(jīng)毒機(jī)理。具有廣泛生物學(xué)功能的條件必須氨基酸—?；撬崾遣溉閯?dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中含量僅次于谷氨酸的游離氨基酸，大量的研究認(rèn)為，?；撬崮艽龠M(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化及延緩神經(jīng)細(xì)胞衰老，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)分泌及某些

3、肽類物質(zhì)含量，調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受多種化學(xué)物質(zhì)損傷等作用而發(fā)揮健腦益智功能，現(xiàn)今已在臨床用于早老性癡呆、各種急慢性腦病的預(yù)防與治療。本課題組前期的研究也觀察到?；撬岣纳坡匀惧i誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，該作用可能與?；撬岜Ｗo(hù)海馬神經(jīng)細(xì)胞免受錳誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，但?；撬釋?duì)于暴露早期出現(xiàn)的神經(jīng)精神癥狀的干預(yù)效果及其機(jī)理尚有待完善。因此，本研究將建立急性、亞慢性染錳動(dòng)物模型，通過Morris水迷宮觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶變化，測定紅細(xì)胞錳

4、濃度，海馬組織膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶的活力以指示乙酰膽堿的代謝變化，進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)方法觀察發(fā)出膽堿能神經(jīng)纖維到海馬的基底前腦膽堿能神經(jīng)元的形態(tài)、數(shù)量變化，最后采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找海馬在不同狀態(tài)下的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并對(duì)部分鑒定的差異蛋白作蛋白、基因表達(dá)水平的進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)?；撬犷A(yù)防及治療的效果進(jìn)行觀察。
　　方法：
　　一、?；撬釋?duì)錳誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的干預(yù)研究
　　急性染毒:100只SPF雄性

5、SD大鼠隨機(jī)分5組，分別為:生理鹽水(NS)對(duì)照組(C)，連續(xù)ip0.9％NS，實(shí)驗(yàn)期限為4w;染錳Ⅰ組(M1)，每日ip MnCl2.4H2O(15mg/kg.d)，連續(xù)4w;?；撬犷A(yù)防組(P)，染錳的同時(shí)ip?；撬?200mg/kg.d)，持續(xù)4w;?；撬嶂委熃M(T)，染錳4w結(jié)束后再ip?；撬?00mg/kg.d，治療4w，即ip MnC12.4H2O28d+ip牛磺酸28d，時(shí)長8w;染錳Ⅱ組(M2)，染錳4w結(jié)束后再ip NS

6、4w，即ipMnCl2.4H2O28d+ip NS28d，實(shí)驗(yàn)期共8w。
　　亞慢性染毒:各組染毒劑量及頻率不變，時(shí)長則延長一倍，即染毒總時(shí)長C、M1、P為8w，T及M2則為16w(8w+8w)。
　　上述兩亞組大鼠分別在最后一次干預(yù)結(jié)束后24h進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，分別以頭5天平均逃避潛伏時(shí)間及第六天的平臺(tái)搜索次數(shù)評(píng)估大鼠空間學(xué)習(xí)能力及空間記憶能力的變化。
　　二、?；撬釋?duì)染錳大鼠紅細(xì)胞錳、鐵含量的干預(yù)研究
　　兩亞

7、組動(dòng)物完成水迷宮后頸椎脫臼處死，迅速開胸采心臟血，抗凝劑抗凝后離心去除白細(xì)胞及血漿蛋白，分離紅細(xì)胞，消化后電感耦合等離子發(fā)光儀測定各組紅細(xì)胞的錳負(fù)荷及鐵含量，反映紅細(xì)胞錳含量作為錳暴露早期觀察指標(biāo)的穩(wěn)定性及與之密切相關(guān)的鐵含量的變化。
　　三、?；撬釋?duì)染錳大鼠海馬乙酰膽堿代謝變化的干預(yù)研究
　　分離各組動(dòng)物的海馬組織，制備組織勻漿液，測定乙酰膽堿合成、分解的兩個(gè)關(guān)鍵酶—膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶及乙酰膽堿酯酶活力以指示海馬組織中乙酰膽堿

8、代謝的變化，探討?；撬釋?duì)急性、亞慢性染錳改變此兩酶活力與學(xué)習(xí)記憶能力影響之間的關(guān)系。
　　四、?；撬釋?duì)染錳大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的干預(yù)研究
　　各染毒組動(dòng)物灌注固定后切片行免疫組化染色，觀察基底前腦膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶陽性神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化，探討染錳及?；撬岣深A(yù)對(duì)基底前腦乙酰膽堿能細(xì)胞影響及其與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系。
　　五、牛磺酸對(duì)染錳大鼠海馬毒性干預(yù)作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　各染毒動(dòng)物分離海馬組織，制備總蛋白進(jìn)行

9、二維電泳分離蛋白，經(jīng)軟件比對(duì)選擇差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，探討牛磺酸干預(yù)對(duì)染錳誘導(dǎo)海馬神經(jīng)毒性的特異靶蛋白。
　　六、?；撬岣深A(yù)對(duì)急性染錳大鼠海馬部分差異蛋白質(zhì)的表達(dá)研究
　　采用蛋白免疫印跡及相對(duì)熒光定量PCR選擇感興趣的差異蛋白進(jìn)一步進(jìn)行蛋白及分子表達(dá)水平的驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　一、?；撬釋?duì)錳誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的干預(yù)研究
　　1、?；撬釋?duì)急性染錳誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的干預(yù)研究
　　水

10、迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:染錳Ⅰ組大鼠平均逃避潛伏時(shí)間(39.8±2.3)s較對(duì)照組(29.5±2.5)s及?；撬犷A(yù)防組(29.4±2.3)s顯著延長（P＜0.05），染錳Ⅱ組(56.6±3.0)s與牛磺酸治療組(27.8±2.3)s相比顯著延長(P＜0.05)，平臺(tái)搜索次數(shù)染錳Ⅰ組(3.2±3.2)較對(duì)照組(4.5±3.5)有降低趨勢，?；撬犷A(yù)防(5.7±3.1)顯示出上調(diào)染錳所致平臺(tái)搜索次數(shù)減少的趨勢，與染錳Ⅱ組(6.1±2.0)相比，?；?/p>

11、酸治療組(4.8±3.3)的平臺(tái)搜索次數(shù)反而減少，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、牛磺酸對(duì)亞慢性染錳誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的干預(yù)研究
　　水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映平均逃避潛伏時(shí)間染錳Ⅰ組(53.6±4.3)較對(duì)照組(38.5±4.3)及?；撬犷A(yù)防組(38.6±4.3)顯著延長（P＜0.05），牛磺酸治療組(39.1±3.5)與較染錳Ⅱ組(56.0±3.8)顯著縮短（P＜0.05），平臺(tái)搜索次數(shù)染錳Ⅰ組(2.0±2.1)較對(duì)照

12、組(7.5±4.3)及?；撬犷A(yù)防組(6.5±3.6)顯著降低（P＜0.05），?；撬嶂委熃M(2.5±2.6)與染錳Ⅱ組(5.4±3.1)相比無顯著差異。
　　二、?；撬釋?duì)染錳大鼠紅細(xì)胞錳、鐵含量的干預(yù)研究
　　4w染錳Ⅰ組大鼠紅細(xì)胞錳含量(0.158±0.017) mg/L較對(duì)照組(0.090±0.006)mg/L顯著增高，?；撬犷A(yù)防(0.154±0.023)mg/L并未顯示出有降低紅細(xì)胞錳含量的效果，其錳負(fù)荷依然顯著高于對(duì)

13、照組，牛磺酸治療組(0.099±0.016)mg/L與染錳Ⅱ組(0.094±0.011)mg/L相比紅細(xì)胞錳含量無差異。8w染錳Ⅰ組大鼠紅細(xì)胞錳(0.134±0.015) mg/L依然高于對(duì)照組，?；撬犷A(yù)防(0.127±0.021) mg/L也未改變紅細(xì)胞錳負(fù)荷狀態(tài)，仍然顯著高于對(duì)照組。與染錳Ⅱ組(0.087±0.006)mg/L相比，?；撬嶂委熃M(0.078±0.006)mg/L紅細(xì)胞錳含量顯著降低。然而，紅細(xì)胞鐵含量在急性、亞慢性染

14、毒及?；撬岣深A(yù)各組中并未觀察到改變。
　　三、?；撬釋?duì)染錳大鼠海馬組織乙酰膽堿代謝變化的干預(yù)研究
　　1、?；撬釋?duì)急性染錳大鼠海馬組織乙酰膽堿代謝變化的干預(yù)研究
　　染錳Ⅰ組海馬組織乙酰膽堿酯酶活力(0.63±0.16)(U/mgprot)與空白對(duì)照組(0.65±0.11)(U/mgprot)相比無顯著差異，但預(yù)防組酶活力(0.23±0.06)(U/mgprot)較之對(duì)照組及染錳Ⅰ組則顯著下降（P＜0.05），染錳Ⅱ組

15、(0.21±0.07)(U/mgprot)較治療組(0.44±0.12)(U/mgprot)顯著降低(P＜0.05);與對(duì)照組比較(24.2±2.5)(IU/g)，染錳Ⅰ組(18.0±9.9)(IU/g)、?；撬犷A(yù)防組(18.9±4.5)的海馬組織乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力稍有降低但并不明顯（P＞0.05），牛磺酸治療組(31.2±10.3)(IU/g)該酶活力則較染錳Ⅱ組(21.16±8.6)(IU/g)顯著上調(diào)（P＜0.05）。
　　

16、2、?；撬釋?duì)亞慢性染錳大鼠海馬組織乙酰膽堿代謝變化的干預(yù)研究
　　染錳Ⅰ組海馬組織乙酰膽堿酯酶活力(0.40±0.26)(U/mgprot)與空白對(duì)照組(0.29±0.10)(U/mgprot)相比有上升趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，?；撬犷A(yù)防(0.20±0.04)(U/mgprot)明顯下調(diào)海馬組織中乙酰膽堿酯酶活力(P＜0.05)，治療組(0.25±0.06)乙酰膽堿酯酶活性較(U/mgprot)染錳Ⅱ組(0.34±0.03)(U/mg

17、prot)顯著降低。染錳Ⅰ組海馬組織乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力(13.24±5.09)(IU/g)較對(duì)照組(30.27±9.47)(IU/g)顯著降低,?；撬犷A(yù)防(20.88±9.50)(IU/g)有上調(diào)錳抑制的乙酰膽堿移酶活力趨勢，但并無顯著效果。牛磺酸治療(31.77±4.60)(IU/g)能顯著增加乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力（P＜0.05）。
　　四、牛磺酸對(duì)染錳大鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的干預(yù)研究
　　1?；撬釋?duì)急性染錳大鼠基底前腦

18、(vDB/HDB)膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的干預(yù)研究
　　與對(duì)照組vDB/hDB(167.17±14.08/150.00±9.86)相比，染錳Ⅰ組vDB/hDB(97.00±11.87/83.67±3.61)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少(p＜0.05)，牛磺酸預(yù)防vDB/hDB(168.50±17.89/115.67±8.98)顯著增加染錳誘導(dǎo)減少的ChAT陽性細(xì)胞(p＜0.05)，vDB數(shù)量甚至可及正常對(duì)照組，hDB盡管也顯著高于染錳Ⅰ組

19、，但仍顯著低于對(duì)照組(p＜0.05);與染錳Ⅱ組vDB/hDB(144.5±12.29/120.33±8.16)相比，?；撬嶂委燂@著增加vDB(163.17±10.50)ChAT陽性細(xì)胞(p＜0.05)，但hDB(116.17±16.13)無顯著差異(p＞0.05)。
　　2、?；撬釋?duì)亞慢性染錳大鼠基底前腦(vDB/hDB)膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的干預(yù)研究
　　與對(duì)照組vDB/hDB(245.0±57.37/184.50±32.09

20、)相比，染錳Ⅰ組vDB/hDB(188.00±26.63/115.17±20.88) ChAT陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少(p＜0.05)，牛磺酸預(yù)防vDB/hDB(167.40±39.81/189.80±48.71)僅能顯著增加hDB染錳誘導(dǎo)減少的ChAT陽性細(xì)胞(p＜0.05)，而vDB甚至無顯性低于染錳組，并顯著低于對(duì)照組(p＜0.05）;?；撬嶂委熃MvDB/hDB(156.40±14.19/195.60±35.54)ChAT陽性細(xì)胞在v

21、DB顯著低于染錳Ⅱ組的相應(yīng)區(qū)域(265.67±49.64)(p＜0.05)，但hDB(116.17±16.13)則與染錳Ⅱ組相應(yīng)區(qū)(165.33±33.24)無顯著差異(p＞0.05)。
　　五、?；撬釋?duì)染錳大鼠海馬毒性干預(yù)作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　1、牛磺酸對(duì)急性染錳大鼠海馬毒性干預(yù)作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　各組凝膠蛋白經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組觀察到(1108+89)個(gè)蛋白點(diǎn)，染錳Ⅰ組觀察到(1005士140)個(gè)蛋白點(diǎn)，?；撬?/p>

22、預(yù)防組觀察到(1218±204)個(gè)蛋白點(diǎn)，染錳Ⅱ組觀察到（1130±151）個(gè)蛋白點(diǎn)，?；撬嶂委熃M觀察到(1099±163)個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)照組—染錳Ⅰ組(C-M)匹配后發(fā)現(xiàn)46個(gè)差異點(diǎn)，染錳Ⅰ組—?；撬犷A(yù)防組(M1-P)匹配后發(fā)現(xiàn)46個(gè)差異點(diǎn)，染錳Ⅱ組—?；撬嶂委熃M(M2-T)匹配后發(fā)現(xiàn)29個(gè)差異點(diǎn)，各差異點(diǎn)表達(dá)變化量≥2倍以上。選擇上述差異點(diǎn)進(jìn)行鑒定，經(jīng)肽指紋圖譜(PFT)及串聯(lián)質(zhì)譜鑒定了35(35/46)、13(13/29)、17(1

23、7/21)各蛋白質(zhì)。C-M1組的35個(gè)差異蛋白中涉及能量代謝、細(xì)胞骨架蛋白、核酸代謝、蛋白代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化調(diào)節(jié)、胞吞作用及新發(fā)現(xiàn)的蛋白，M1-p組的13個(gè)差異蛋白包含能量代謝、細(xì)胞骨架、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白、中間蛋白、分子伴侶、氧化調(diào)節(jié)蛋白等，M2-T組的17個(gè)差異蛋白涉及能量代謝、細(xì)胞骨架、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、蛋白調(diào)節(jié)與代謝、脂質(zhì)代謝、分子伴侶、囊泡運(yùn)輸、胞吞調(diào)節(jié)、神經(jīng)發(fā)育與分化及新發(fā)現(xiàn)的蛋白等。
　　2、?；撬釋?duì)亞慢性染錳

24、大鼠海馬毒性干預(yù)作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　各組凝膠經(jīng)圖像分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組觀察到(997±110)個(gè)蛋白點(diǎn)，染錳Ⅰ組觀察到(1008±94)個(gè)蛋白點(diǎn)，牛磺酸預(yù)防組觀察到(1107±185)個(gè)蛋白點(diǎn)，染錳Ⅱ組觀察到(1201±147)個(gè)蛋白點(diǎn)，?；撬嶂委熃M觀察到(1312±179)個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)照組—染錳Ⅰ組(C-M1)匹配后發(fā)現(xiàn)12個(gè)差異點(diǎn)，染錳Ⅰ組—?；撬犷A(yù)防組(M1-P)匹配后發(fā)現(xiàn)8個(gè)差異點(diǎn)，染錳Ⅱ組—?；撬嶂委熃M(M2-T)匹配

25、后發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異點(diǎn)，各差異點(diǎn)表達(dá)變化量≥2倍以上。選擇上述差異點(diǎn)進(jìn)行鑒定，經(jīng)肽指紋圖譜(PFT)及串聯(lián)質(zhì)譜鑒定了8(8/12)、2(2/8)、4(4/17)個(gè)蛋白質(zhì)，C-M1的8個(gè)蛋白涉及酶、細(xì)胞骨架、氧化還原調(diào)節(jié)、鈣調(diào)家族、胞吐作用調(diào)節(jié)、激素刺激調(diào)節(jié)等，M1-P組兩個(gè)已鑒定蛋白分別是prepro-A-type allatostatin及膠原纖維酸性蛋白，M2-T組4個(gè)蛋白涉及細(xì)胞骨架、細(xì)胞粘附及蛋白去折疊。
　　六、?；撬岣深A(yù)對(duì)

26、急性染錳大鼠海馬部分差異蛋白質(zhì)的表達(dá)研究
　　染錳Ⅰ組及?；撬犷A(yù)防組HSP7的表達(dá)量較對(duì)照組小幅升高，但無差異;治療組與染錳Ⅱ組間亦無差異。染錳Ⅰ組Prx3較對(duì)照組降低，?；撬犷A(yù)防或治療組Prx3的表達(dá)量稍低于相同染毒時(shí)長的染錳組，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)照組、染錳Ⅰ組及?；撬犷A(yù)防組間HSP7 mRNA表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，而治療組HSP7mRNA顯著高于染錳Ⅱ組;染錳后Prx3mRNA表達(dá)降低，?；?/p>

27、酸預(yù)防或治療對(duì)該基因表達(dá)與同時(shí)長染錳組相比無差異(P＞0.05);染錳Ⅰ組NDUFS1mRNA表達(dá)較對(duì)照組低，牛磺酸預(yù)防提高該基因表達(dá)，但差異不顯著(P＞0.05)，治療組mRNA表達(dá)顯著高于染錳Ⅱ組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、?；撬犷A(yù)防或治療可改善急性、亞慢性染錳誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　2、?；撬峥赏ㄟ^調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)而影響急性、亞慢性染錳誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　3、蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)揭示急性、亞慢性