Cbl-b介導(dǎo)FLIPL的降解調(diào)控三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 在過(guò)去的20多年里，三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)被成功的用于多種血液惡性腫瘤疾病的治療，最近的臨床試驗(yàn)證實(shí)，在其他實(shí)體腫瘤中，ATO也顯示了很好的臨床應(yīng)用前景。其多種作用機(jī)制被廣泛的探討，例如刺激細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，自噬在調(diào)控腫瘤細(xì)胞存活的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。自噬可能扮演著雙面角色，既能誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)放化療抵抗，又能導(dǎo)致自噬性死亡，這可能與腫瘤細(xì)胞的類(lèi)型，腫瘤

2、發(fā)生的不同階段，藥物作用的不同信號(hào)通路密切相關(guān)。目前文獻(xiàn)表明，ATO在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)能明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生，然而，具體的信號(hào)機(jī)制尚不明確，值得進(jìn)一步研究。
　　 c-FLIP(cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β-convertingenzyme inhibitory protein)主要功能是抑制死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，通常在多種腫瘤組織中表達(dá)

3、，在蛋白水平上主要有2種形式，包括長(zhǎng)片段的FLIPL、短片段的FLIPs。目前大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道FLIPL在調(diào)控死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮主要的生物學(xué)功能，該基因通過(guò)與caspase-8競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合從而阻斷凋亡通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。最近研究表明，ATO通過(guò)抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)FLIP表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而，F(xiàn)LIP是否參與ATO誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬調(diào)控未見(jiàn)報(bào)道。
　　 Cbl(Casitas B-lineage Lymph

4、oma)家族蛋白，作為E3泛素連接酶，在調(diào)控泛素化底物蛋白的降解進(jìn)而影響細(xì)胞功能方面發(fā)揮著重要作用，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)Cbl蛋白能與多種受體/非受體酪氨酸激酶底物結(jié)合，誘導(dǎo)其泛素化降解，我們既往的研究顯示ATO可上調(diào)Cbl-b表達(dá)，然而Cbl-b能否通過(guò)泛素化FLIPL參與ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬尚不清楚。
　　 為深入闡述ATO誘導(dǎo)自噬的作用機(jī)制，本研究以慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562、急性T淋巴白血病細(xì)胞系Jurkat、胃癌細(xì)胞系M

5、GC803和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為ATO誘導(dǎo)自噬模型，研究FLIPL及泛素連接酶Cbl-b在調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程中的作用，進(jìn)一步以胃癌細(xì)胞系MGC803為模型，通過(guò)RNA干擾技術(shù)，探討ATO誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。
　　 材料與方法
　　 1、采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法或MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。
　　 2、采用流式細(xì)胞儀通過(guò)PI染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡判定。
　　 3、采用Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)。
　

6、　 4、免疫共沉降檢測(cè)蛋白間的共結(jié)合。
　　 5、透射電子顯微鏡檢測(cè)自噬體形成。
　　 6、采用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以Means±SD.表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、ATO誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬
　　 (一)ATO抑制K562、Ju

7、rkat、MGC803和MCF-7細(xì)胞增殖。ATO作用K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)，明顯抑制上述細(xì)胞的增殖。24小時(shí)的抑制細(xì)胞增殖50％的藥物濃度(IC50)分別是4.59±1.53μM、5.92±1.39μM、49.76±8.34μM和59.33±7.90μM。
　　 (二)ATO誘導(dǎo)K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。ATO作用K562和Jurkat細(xì)

8、胞(5μM)、MGC803和MCF-7細(xì)胞(20μM)12小時(shí)和24小時(shí)，Western blot顯示凋亡相關(guān)蛋白PARP發(fā)生裂解，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ水平升高。ATO作用K562和MGC803細(xì)胞12小時(shí)，透射電子顯微鏡觀察到在細(xì)胞胞漿中大量的自噬體形成，直徑在300-900 nm之間。
　　 (三)ATO誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬。在K562和MGC803細(xì)胞中，自噬抑制劑氯喹(CQ)(20μM)明顯增強(qiáng)ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑

9、制和凋亡。
　　 二、FLIPL參與調(diào)控ATO誘導(dǎo)的自噬
　　 (一)ATO誘導(dǎo)K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細(xì)胞FLIPL水平下調(diào)。ATO作用K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細(xì)胞從1小時(shí)到24小時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示FLIPL水平以時(shí)間依賴方式下調(diào)。
　　 (二)MGC803細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA，細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。使用siRNA干擾技術(shù)，MGC

10、803細(xì)胞轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA48小時(shí)后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染的MGC803細(xì)胞發(fā)生PARP裂解和LC3-Ⅱ水平增加。
　　 (三)瞬時(shí)干涉MGC803細(xì)胞中FLIPL的表達(dá)，ATO誘導(dǎo)的自噬明顯增強(qiáng)。MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA48小時(shí)后，ATO(20μM)處理24小時(shí)，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA組LC3-Ⅱ水平進(jìn)一步增加。
　　

11、 (四)透射電鏡顯示下調(diào)MGC803細(xì)胞FLIPL蛋白表達(dá)，ATO誘導(dǎo)的自噬體增多。MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA48小時(shí)后，ATO(20μM)處理12小時(shí)，透射電子顯微鏡證實(shí)轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA組胞漿內(nèi)自噬體的數(shù)量較對(duì)照組明顯增多。
　　 三、Cbl-b調(diào)控FLIPL的泛素化降解參與ATO誘導(dǎo)的自噬
　　 (一)蛋白酶體通路參與ATO誘導(dǎo)的K562和MGC803細(xì)胞FLIPL降解。蛋白酶體抑制劑(PS

12、341)(5nM)預(yù)處理K562和MGC803細(xì)胞12小時(shí)，之后ATO作用6小時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示ATO誘導(dǎo)的FLIPL降解被抑制。
　　 (二)ATO誘導(dǎo)K562和MGC803細(xì)胞FLIPL泛素化。ATO作用K562細(xì)胞3小時(shí)或MGC803細(xì)胞1小時(shí)，免疫共沉淀顯示ATO上調(diào)FLIPL酪氨酸磷酸化水平，誘導(dǎo)FLIPL泛素化。
　　 (三)ATO誘導(dǎo)K562和MGC803細(xì)胞上調(diào)Cbl-b蛋白表達(dá)。A

13、TO作用K562細(xì)胞或MGC803細(xì)胞從1小時(shí)到24小時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示ATO誘導(dǎo)K562和MGC803細(xì)胞以時(shí)間依賴方式上調(diào)Cbl-b。
　　 (四)ATO誘導(dǎo)K562和MGC803細(xì)胞FLIPL與Cbl-b發(fā)生共結(jié)合。K562和MGC803細(xì)胞經(jīng)蛋白酶體抑制劑PS341(5 nM)預(yù)處理12小時(shí)，之后ATO作用3小時(shí)，免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果顯示ATO誘導(dǎo)FLIPL與Cbl-b發(fā)生共結(jié)合。
　　 (五

14、)Cbl-b參與ATO誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞FLIPL的泛素化。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cbl-b
　　 shRNA或空載體的MGC803細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶體抑制劑PS341(5nM)預(yù)處理12小時(shí)，之后ATO作用1小時(shí)、3小時(shí)，免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cbl-b shRNA的MGC803細(xì)胞，明顯抑制ATO誘導(dǎo)的FLIPL泛素化。
　　 (六)Cbl-b參與ATO誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞自噬調(diào)控。在MGC803細(xì)胞中，敲除C

15、bl-b，F(xiàn)LIPL蛋白水平增加，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ水平減少。ATO作用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cbl-b shRNA或空載體的MGC803細(xì)胞12小時(shí)，Western blot結(jié)果顯示敲除Cbl-b，明顯抑制ATO誘導(dǎo)的自噬水平，透射電子顯微鏡證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cbl-b shRNA的MGC803細(xì)胞自噬體明顯減少。
　　 結(jié)論
　　 1、ATO抑制K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和保護(hù)性自噬