溫度對(duì)基于光授時(shí)信號(hào)途徑的家蠶BmN細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)的影響.pdf

1、生物節(jié)律廣泛存在于生物界,從原核單細(xì)胞到高等動(dòng)植物,包括人類的生命活動(dòng)都在生物鐘控制下進(jìn)行。生物鐘系統(tǒng)由授時(shí)信號(hào)輸入通道、核心振蕩器和信號(hào)輸出通道組成。細(xì)胞和組織雖然脫離了生物體中樞神經(jīng)的調(diào)控,但是其內(nèi)部的外周生物鐘也具有內(nèi)源性節(jié)律。昆蟲的許多生理活動(dòng)和行為如孵化、羽化、取食、代謝、交配產(chǎn)卵、眠起,甚至免疫和學(xué)習(xí)記憶等都表現(xiàn)出一定的生物節(jié)律。光照作為昆蟲最重要的授時(shí)因子,在果蠅等模式昆蟲中其輸入途徑和反饋環(huán)路的研究已經(jīng)非常深入,但是溫度

2、授時(shí)因子的作用機(jī)制還沒有得到闡明,其重要的原因是缺乏有效的生物模型。本文在基于光授時(shí)因子信號(hào)環(huán)路的基礎(chǔ)上,利用qRT-PCR、Western blotting、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段,研究了家蠶BmN細(xì)胞生物鐘基因Cryl、Cry2、Per、Tim以及相應(yīng)的蛋白質(zhì),在不同的溫度循環(huán)和高溫刺激處理下節(jié)律振蕩的表達(dá)特征。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、偶倚Q生物鐘蛋白的亞細(xì)胞定位。在26℃、12 h L:12 h D條件下,家蠶B m N細(xì)

3、胞中生物鐘蛋白CRY1、CRY2、PER和TIM的表達(dá)能夠響應(yīng)光照刺激,并且對(duì)光照產(chǎn)生了節(jié)律振蕩。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,在12 h L:12 h D晝夜光振蕩節(jié)律變化過程中,CRY1沒有在細(xì)胞核出現(xiàn),只存在于細(xì)胞質(zhì)中;CRY2穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì),但有少量入核;PER在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都存在;而T IM光照時(shí)入核,黑暗時(shí)則從細(xì)胞核返回細(xì)胞質(zhì)。推測(cè)CRY1是光信號(hào)受體,將刺激傳遞給CRY2、PER和TIM,三者可能進(jìn)一步結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)

4、揮轉(zhuǎn)錄抑制作用,其中T IM可能在細(xì)胞質(zhì)中還有負(fù)反饋信號(hào)作用。
　?、?7C瞬時(shí)高溫刺激對(duì)家蠶BmN細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)的影響。為了驗(yàn)證生物鐘基因是否響應(yīng)溫度信號(hào),用37C瞬時(shí)高溫刺激30 m in的處理方法,調(diào)查家蠶BmN細(xì)胞在瞬時(shí)高溫刺激之后的48 h中,光授時(shí)因子負(fù)反饋信號(hào)通路核心生物鐘基因Cryl、Cry2、Per和 Tim的表達(dá)情況。結(jié)果表明,37C瞬時(shí)高溫刺激能夠誘導(dǎo)了BmN細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因表達(dá)的節(jié)律振蕩,表現(xiàn)為表達(dá)量增

5、加以及波動(dòng)性增強(qiáng),其中CryJ、 Cry2和P e r基因的表達(dá)量振幅變化顯著,只有Tim沒有發(fā)生顯著變化。Cry2進(jìn)一步表現(xiàn)出相位前移與振蕩周期變長(zhǎng),而CryJ表現(xiàn)出振蕩周期變短。推測(cè)C ry J和Cry2可能是溫度授時(shí)因子響應(yīng)的主要基因,P e r基因的作用相對(duì)較弱,而T im基因可能與溫度授時(shí)因子的信號(hào)響應(yīng)沒有直接關(guān)系。
　?、菧囟裙?jié)律處理下BmN細(xì)胞生物鐘基因及其蛋白的表達(dá)特征。在恒明、2℃振蕩溫度(12 h26℃:12

6、h28° C)節(jié)律下,束梅影(2013)的研究表明,生物鐘基因C ry l、Cry2、P e r和 T im的表達(dá)都發(fā)生節(jié)律振蕩。本文進(jìn)一步使用Western blotting方法在蛋白質(zhì)水平上的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),只有C R Y1蛋白質(zhì)含量發(fā)生了節(jié)律振蕩變化,而CRY2、P E R和T IM都沒有出現(xiàn)與基因表達(dá)量相符合的節(jié)律振蕩。推測(cè)可能是2℃溫差在不足以引起B(yǎng) m N細(xì)胞的生物鐘蛋白水平對(duì)溫度信號(hào)的響應(yīng)。進(jìn)一步在恒明、5℃振蕩溫度(12 h2

7、0C:12 h25℃或12 h25C:12 h30 C)節(jié)律下調(diào)查發(fā)現(xiàn),C ry l和Cry2的基因表達(dá)對(duì)溫度變化響應(yīng)敏感,而在恒暗5℃振蕩溫度節(jié)律下,CryJ和Per基因表達(dá)對(duì)溫度變化響應(yīng)敏感。推測(cè)光照的存在可能會(huì)影響溫度的作用。在此基礎(chǔ)上,選擇在恒暗、10℃振蕩溫度(12 h20C:12 h30C)變化鑒定生物鐘基因和蛋白對(duì)溫度振蕩變化的響應(yīng),結(jié)果觀察到基因和蛋白的同步節(jié)律振蕩變化,并觀察到CryI(CRY1)和Per(P E R)