烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠生物鐘基因及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的影響.pdf

1、1、研究背景
　　 睡眠障礙是一種持續(xù)相當(dāng)長時(shí)間的睡眠質(zhì)和（或）量讓人不滿意的狀況，主要表現(xiàn)為入睡困難、維持睡眠困難、過早覺醒和睡后無恢復(fù)感。當(dāng)今社會(huì)，人類面臨的壓力空前膨脹，老齡化人口急劇增長，睡眠障礙已成為“悄然擴(kuò)展的流行病”嚴(yán)重危害人類健康，一項(xiàng)睡眠問卷調(diào)查顯示，我國睡眠障礙患病率高達(dá)42.7％，其中失眠是各種睡眠障礙最常見的癥狀，對(duì)成人失眠癥流行情況的調(diào)查結(jié)果有相當(dāng)大的差異，位于10.2％-37.8％之間，女性發(fā)病率明顯

2、高于男性，年齡越大，失眠發(fā)病率越高。慢性疾病是失眠非常重要的危險(xiǎn)因子，據(jù)統(tǒng)計(jì)，75％-90％的失眠患者有伴隨疾病狀態(tài)的并發(fā)性失眠，特別是年齡超過45歲的患者，其失眠大多與腦動(dòng)脈硬化及頸椎病引起的慢性腦供血不足有關(guān)，但慢性腦缺血與睡眠障礙相關(guān)性的流行病學(xué)調(diào)查鮮有報(bào)道。我們的前期實(shí)驗(yàn)采用小平臺(tái)水環(huán)境法監(jiān)測大鼠睡眠狀態(tài)。大鼠保持覺醒狀態(tài)時(shí)，能立于高于水平面的小平臺(tái)上，否則落水，則落水次數(shù)與睡眠時(shí)間負(fù)相關(guān)。結(jié)果證實(shí)慢性腦缺血大鼠落水次數(shù)較正常大

3、鼠顯著下降，這提示慢性腦缺血大鼠保持更高的覺醒度。該實(shí)驗(yàn)首次利用睡眠剝奪模型在行為學(xué)上證實(shí)睡眠障礙和慢性腦缺血確有相關(guān)性，但分子機(jī)制仍不明確。
　　 腦缺血是腦灌流動(dòng)脈狹窄或閉塞所引起的一種很常見的缺血性腦血管疾病。其病因復(fù)雜，缺乏能逆轉(zhuǎn)缺血病灶的藥物，更沒有專門應(yīng)用于防治其伴發(fā)的睡眠障礙的藥物，只是籠統(tǒng)的利用鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗組胺等療法解決患者繼發(fā)失眠問題，往往副作用大、容易成癮。中醫(yī)認(rèn)為“眩暈”、“頭痛”、“失眠”、“健忘

4、”等均有“慢性腦缺血”的病理生理基礎(chǔ)，因此利用中藥復(fù)方多成分，多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，采用改善腦供血的方法治療失眠收效良好。
　　 “烏龍丹”是臨床用于腦供血不足的經(jīng)驗(yàn)方，常用于治療腦梗塞、腦栓塞、短暫性腦缺血發(fā)作、中風(fēng)后遺癥及恢復(fù)期、腦動(dòng)脈硬化、腦萎縮及高血壓頭暈頭痛、頸椎?。ㄗ?基底動(dòng)脈供血不足型）、顱腦外傷或手術(shù)后遺癥等缺血性腦病，效果顯著，現(xiàn)已經(jīng)開始用于治療慢性腦缺血相關(guān)的睡眠障礙。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明烏龍丹具有擴(kuò)張腦血管、抗

5、血小板聚集、改善血液流變性和微循環(huán)等作用，能上調(diào)大鼠皮層及海馬區(qū)NR1、NR2B的蛋白表達(dá)水平，改善慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及大鼠避暗實(shí)驗(yàn)中，烏龍丹能縮短大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期，減少錯(cuò)誤次數(shù)，提高大鼠的空間學(xué)習(xí)能力及被動(dòng)學(xué)習(xí)能力;通過檢測，我們還發(fā)現(xiàn)長期持續(xù)的慢性腦供血不足，導(dǎo)致食欲素原mRNA的表達(dá)升高，激活了食欲素神經(jīng)元，作為覺醒啟動(dòng)子之一的食欲素系統(tǒng)可以增加覺醒、抑制睡眠，在睡眠的中樞調(diào)節(jié)作用中起著關(guān)鍵的

6、作用。前期的實(shí)驗(yàn)從行為學(xué)上初步證實(shí)了睡眠障礙與慢性腦缺血有明確相關(guān)性，但對(duì)其具體分子機(jī)制只做了初探，且烏龍丹對(duì)睡眠障礙——慢性腦缺血可能潛在的并發(fā)癥是否有治療作用的靶點(diǎn)，尚不清楚。
　　 2、目的和意義
　　 針對(duì)以上提出的2個(gè)問題:
　　 1、慢性腦缺血伴發(fā)睡眠障礙的具體機(jī)制不明;
　　 2、烏龍丹對(duì)慢性腦缺血伴發(fā)睡眠障礙的作用靶點(diǎn)未知，本實(shí)驗(yàn)選取與睡眠-覺醒周期密切相關(guān)的生物鐘基因與中樞神經(jīng)遞質(zhì)作為檢

7、測指標(biāo)，旨在分子水平進(jìn)一步證實(shí)大鼠慢性腦缺血與睡眠障礙的相關(guān)性，探索慢性腦缺血伴發(fā)睡眠障礙的具體機(jī)制。同時(shí)，初步定位烏龍丹治療大鼠慢性腦缺血伴發(fā)睡眠障礙的作用靶點(diǎn)，為其臨床治療慢性腦缺血伴發(fā)失眠提供理論依據(jù)。
　　 3、實(shí)驗(yàn)方法
　　 3.1、烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠松果體鐘基因表達(dá)的影響
　　 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、模型組、烏龍丹給藥組[相當(dāng)于生藥量4.4 g/(kg·d)]，每組5只。采

8、用改良式雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法建立大鼠慢性腦缺血模型，假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎，其余處理同手術(shù)組。造模3周后，灌胃給藥3周，并持續(xù)監(jiān)測各組大鼠體重。SYBRGreen實(shí)時(shí)定量PCR檢測大鼠松果體鐘基因Clock、Bmal1、Perl表達(dá)的變化。
　　 3.2、烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠中樞氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響
　　 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、模型組、烏龍丹給藥組[相當(dāng)于生藥量4.4 g/

9、(kg·d)]，每組4只。采用改良式雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法建立大鼠慢性腦缺血模型，假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎，其余處理同手術(shù)組。造模3周后進(jìn)入慢性腦缺血期，繼而灌胃給藥，3周后，處死并冰臺(tái)上分離大鼠海馬及腦干，冷凍離心后分離上清液，采用高效液相色譜熒光檢測法對(duì)大鼠腦干和海馬的天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸進(jìn)行定量。色譜條件:Hypersil ODS色譜柱，4.0×125 mm，粒徑5μm;流動(dòng)相(A):10 mmol·

10、L-1 Na2HPO4 PH7.2緩沖液(PB);流動(dòng)相(B):PB+甲醇+乙腈(50+35+15)。線性梯度:在0～10min內(nèi)，流動(dòng)相B以線性從0％上升到40％。流量:1.0 mL·min-1。柱溫40℃。檢測波長:激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長450nm。
　　 3.3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示，統(tǒng)計(jì)方法使用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，單因素方差分析(O

11、ne-way ANOVA)。方差齊時(shí)，總體均數(shù)的比較采用one-way ANOVA，各組間多重比較采用LSD法和Dunnett-t法，方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welch法，各組間多重比較采用Dunnett's T3法檢驗(yàn)。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、結(jié)果
　　 4.1、烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠體重的影響
　　 假手術(shù)組體重呈進(jìn)行性增長，精神狀態(tài)良好、反應(yīng)靈敏、皮毛光澤;模型組大鼠體重增長緩慢，反應(yīng)遲

12、鈍、皮毛枯萎。結(jié)果顯示術(shù)前各組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，術(shù)后1周模型組與假手術(shù)組體質(zhì)量有顯著差異(P=0.015)。術(shù)后3周進(jìn)入慢性腦缺血期，繼而給藥3周，測量終體質(zhì)量，模型組體質(zhì)量顯著低于假手術(shù)組(P=0.000)和給藥組(P=0.013)，給藥組與假手術(shù)組無顯著差異。
　　 4.2、烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠松果體鐘基因表達(dá)的影響
　　 結(jié)果顯示，模型組大鼠松果體Clock mRNA的表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)

13、，給予烏龍丹后上調(diào)了慢性腦缺血大鼠Clock mRNA的表達(dá)水平(P＜0.01);模型組大鼠松果體Perl mRNA的表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05);烏龍丹干預(yù)后未見顯著差異;慢性腦缺血不影響大鼠Bmal1表達(dá)。
　　 4.3、烏龍丹對(duì)慢性腦缺血大鼠中樞氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響
　　 結(jié)果表明，慢性腦缺血模型未能影響海馬天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸含量的變化，但能導(dǎo)致興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸含量的顯著上

14、升(P＜0.05)，給予烏龍丹治療后，慢性腦缺血大鼠海馬谷氨酸含量顯著降低至正常水平(P＜0.05);海馬各組間興奮性氨基酸含量總和與抑制性氨基酸含量總和的比值有顯著差異，與假手術(shù)組相比，模型組比值顯著升高(P＜0.01)，與模型組相比，給藥組比值顯著降低(P＜0.05)，給藥組和假手術(shù)組無顯著差異;模型組與假手術(shù)(P＜0.05)、給藥組(P＜0.05) Glu/GABA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢性腦缺血模型未能影響腦干天冬氨酸、谷氨酸、γ

15、-氨基丁酸含量的變化，但導(dǎo)致抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)甘氨酸含量的顯著降低(P＜0.01)，烏龍丹能增加慢性腦缺血大鼠腦干甘氨酸含量(P＜0.05);各組間興奮性氨基酸含量總和與抑制性氨基酸含量總和的比值有顯著差異，與假手術(shù)組相比，模型組比值顯著升高(P＜0.01)，與模型組相比，給藥組比值顯著降低(P＜0.05)，給藥組和假手術(shù)組無顯著差異;但Glu/GABA各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5、結(jié)論
　　 5.1、慢性腦缺血改

16、變大鼠生物鐘基因的表達(dá)
　　 慢性腦缺血下調(diào)大鼠松果體Clock、Perl基因的表達(dá)，提示慢性腦缺血可能通過調(diào)控節(jié)律基因的表達(dá)而導(dǎo)致失眠。
　　 5.2、慢性腦缺血影響大鼠中樞氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放
　　 慢性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的興奮狀態(tài)占優(yōu)勢(shì)，致使興奮性神經(jīng)遞質(zhì)增加，而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)減少。提示慢性腦缺血為睡眠障礙的潛在病因。
　　 5.3、烏龍丹改善慢性腦缺血大鼠鐘基因與氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)